La principale contribution de notre article est que nous avons exploré un paysage précis et fin de la pathologie bêta-amyloïde du cerveau de la maladie d’Alzheimer avec la technologie d’imagerie de la spectrométrie de masse d’imagerie MALDI. Nous avons réalisé des progrès technologiques en générant un protocole spécial avec l’acide formic pré-traitement des diapositives tissulaires. Après MALDI-IMS, des cartes de segmentation sont générées et des calculs sont effectués pour découvrir de nouvelles protéines marqueurs ou peptides colocalisés avec de la plaque et de la vasculature sous-arachnoïdien.
Obtenez des échantillons corticals humains pour le SMU à partir de cerveaux qui ont été enlevés, traités et stockés à moins 80 degrés Celsius dans les huit heures suivant la mortem. Prenez le spécimen de cerveau du cortex occipital des patients d’ANNONCE et des contrôles âge-assortis. Pour couper les sections tissulaires sur un cryostat, placez d’abord l’oxyde d’étain conductrice d’indium ou les glissières en verre de microscope enduites d’ITO à l’intérieur du cryostat.
Réchauffez le spécimen de cerveau d’autopsie de moins 80 degrés Celsius à moins 22 degrés Celsius à l’intérieur du cryostat. Attachez une nouvelle lame jetable au cryostat pour chaque expérience. Essayez toujours d’utiliser une partie propre de la lame.
Mettez les cerveaux d’autopsie congelés sur la scène avec une petite quantité de composé optimal de température de coupe. Pour le SMU et l’immunohistochimie, couper cinq à six sections de chaque échantillon de tissu. Lorsque la lame commence tout juste à couper le tissu, tournez la roue et faites face au bloc jusqu’à ce que tout le tissu soit exposé.
S’il y a une petite strie ou une déchirure sur la section, attendez dans le cryostat jusqu’à ce que l’ajustement de température le corrige automatiquement. Comptez quelques secondes avant d’ouvrir l’anti-roulis avec un tissu en dessous. Placez immédiatement la tranche de tissu sur le côté recouvert d’ITO de la lame de verre.
Décongeler la tranche de tissu en mettant un doigt sous la lame sur le côté non-ITO-enduit. Le tissu collera à la lame. Assurez-vous que le tissu est aussi plat que possible sans rides.
Pour rincer les sections tissulaires, immerger les échantillons dans 40 à 100 millilitres de 70% d’éthanol dans un bocal de coloration en verre pendant 30 secondes pour éliminer les lipides endogènes et les sels inorganiques. Lavez les échantillons à l’aide de la séquence de lavage indiquée dans le protocole texte. Ensuite, séchez les échantillons dans le vide pendant 30 minutes.
Maintenant, traitez les sections de tissu avec une vapeur acide formic pour une meilleure ionisation des protéines bêta amyloïdes du tissu cérébral d’autopsie. Pour ce faire, préparer le four à 60 degrés Celsius et un plat en verre d’incubation avec cinq millilitres d’acide 100% formic. Maintenir l’humidité de l’air dans le plat en verre d’incubation au niveau de saturation.
Placez les diapositives tissulaires dans le plat en verre d’incubation tout en évitant la submersion dans l’acide formique et traitez pendant six minutes. Prenez une image optique des échantillons à l’aide d’un scanner de film, d’un scanner de gel ou d’un microscope numérique. Effectuez cette étape à température ambiante.
L’alignement de l’image optique des échantillons est nécessaire lorsque la cible de l’échantillon est placée à l’intérieur de l’instrument. Habituellement, il ne sera pas possible de reconnaître la section tissulaire sous la couche matricielle. Pour corréler les images optiques avec les échantillons, faites des marques de guide visibles à la fois dans l’image optique et sous la couche matricielle dans l’optique de la caméra.
Le moyen le plus simple est de repérer au moins trois marques de liquide de correction autour de l’échantillon avant de prendre l’image optique. Pour pulvériser la matrice à l’aide d’un pulvérisateur à ultrasons, retirez le tissu à pulvériser du dessiccateur et placez-le dans la chambre. Assurez-vous que le tissu ne couvre pas la fenêtre du capteur.
Commencez la préparation en appuyant sur le bouton Démarrer. Habituellement, le temps de préparation est d’environ 90 minutes. La préparation sera réglée automatiquement par la surveillance de l’épaisseur et de l’humidité de la couche matricielle.
Alternativement, pour pulvériser la solution matricielle sur la surface du tissu avec un pulvérisateur automatique, utilisez un système de pompe à solvant réglé à 10 psi et 0,15 millilitres par minute pour fournir la solution matricielle. Un flux constant de gaz de gaine chauffé sera livré conjointement avec le spray de solution matricielle. Effectuez des expériences d’imagerie à haut débit et à haute résolution spatiale avec MALDI-IMS.
Pour la mesure de la spectrométrie de masse, définissez les zones tissulaires à l’aide du logiciel de contrôle MALDI et du logiciel d’analyse de données. Acquérir des spectres en mode linéaire positif avec une plage de rapport masse/charge de 2 000 à 20 000 et une résolution spatiale de 20 et 100 microns. Pour faire la norme d’étalonnage, dissoudre la norme d’étalonnage peptidique et la norme d’étalonnage des protéines dans un rapport d’un à quatre avec la solution CHCA et TA30, puis la diluer 10 fois.
Placez un microlitre de norme d’étalonnage sur la glissière à quatre endroits différents. À l’aide d’un logiciel d’histologie moléculaire, superposez plusieurs images de signaux pour trouver la corrélation spatiale de divers signaux tels que différents peptides bêta-amyloïdes colocalisant dans les plaques séniles et les parois artérielles. L’angiopathie amyloïde cérébrale ou phénotypes caa du patient numéro trois étaient les plus importants dans cette étude.
MALDI-IMS de ce patient' le tissu de cerveau de s a clairement visualisé que la bêta amyloïde 1-42 et la bêta amyloïde 1-43 ont été préférentiellement déposées comme plaques séniles dans le parenchyme cérébral. En revanche, les bêtas amyloïdes plus courtes telles que la bêta amyloïde 1-36 à 1-41 ont été préférentiellement déposées sur les secteurs vasculaires leptomeningeal. Il n’y avait aucun signe significatif dans le contrôle non pathologique.
Les distributions de bêta amyloïde 1-40 et de bêta amyloïde 1-42 ont été validées davantage avec l’immunohistochimie utilisant les sections congelées adjacentes des tissus. L’anticorps bêta anti-amyloïde 1-40 étiqueté CAA et a indiqué bêta amyloïde 1-40 est préférentiellement déposé dans les vaisseaux sanguins leptomeningeal, qui est le contraste clair à la distribution de bêta amyloïde 1-42 dans le parenchyma cérébral comme plaques séniles. Il s’agit ici d’une carte de segmentation obtenue avec une analyse k-moyens en deux appliquée à la même section à partir du patient numéro trois.
Cette méthode de regroupement a permis d’identifier avec succès des structures en plaques dans le parenchyme et des structures vasculaires dans l’espace sous-arachnoïdien. Il est intéressant de trouver une petite zone circulaire dans le parenchyme qui est détecté juste autour d’un petit artériole dans le parenchyme ainsi que dans l’espace sous-arachnoïdien. Ceci est vérifié par des images d’ion unique de ces peptides bêta amyloïdes individuels.
Il y a une limite pour tracer un large éventail de bêtas amyloïdes simultanément même si l’on utilise les anticorps spécifiques. Ici, nous montrons la distribution de la bêta amyloïde dans les cerveaux humains en utilisant la méthode de spectrométrie de masse d’imagerie MALDI de pointe. Nous croyons que cette contribution fait une percée dans la recherche sur la maladie d’Alzheimer parce que ce rapport offre la caractérisation de l’ensemble complet des protéines bêta-amyloïdes dans les cerveaux autopsiés par l’homme.
La conclusion la plus impressionnante est qu’une seule altération des acides aminés au terminal C de la protéine bêta amyloïde apporte un changement radical dans leur distribution. Les étapes de préparation des tissus sont essentielles pour obtenir une ionisation efficace des protéines agrégées dans le tissu cérébral humain. Cocrystallization homogène de l’analyte avec des matrices cruciales pour la sensibilité élevée et l’imagerie sans artefact.
