This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1. Cellule de placage et transfection <ol><li> Dans une hotte de culture cellulaire, plaque ~ 300.000 à ~ 500.000 SN56 cellules (une sorte cadeaux du Dr Jane Rylett) sur une boîte de 35 mm confocale à fond de verre et couvrir avec les médias pré-transfection (milieu Eagle modifié de Dulbecco, DMEM, complétée par 10% de FBS). </li><li> Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% à proliférer. Remarque: Les cellules doivent être d&#39;environ 50% -70% de confluence avant transfection. </li><li> Dans une hotte de culture de cellules, les cellules transfecter avec des plasmides exprimant une protéine fluorescente marqués marqueur TGN (Galactosyl transférase couplé à Cyan Fluorescent Protein, GalT-PCP), une protéine fluorescente étiqueté compartiment marqueur (ici, lysosome associated membrane protein 1, LAMP1, marqués avec mRFP), et la protéine d&#39;intérêt marqués avec paGFP (ßAPP-paGFP). (Ces constructions ont déjà été décrits 30) </li><li> Incuber les cellules avec un réactif de transfection et l&#39;ADN plasmidique fou 24 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Utiliser un rapport de ~ 2 pg d&#39;ADN de 5 pi d&#39;agent de transfection (par exemple, Lipofectamine 2000) à meilleur équilibre de la cytotoxicité et l&#39;efficacité de transfection. Peuvent avoir besoin d&#39;être optimisé pour différentes concentrations réelles plasmides. Dans les expériences décrites ici, utiliser 1 ug / plat confocale de ßAPP-paGFP, 0,3 pg / plat confocale de LAMP1-mRFP, et 0,2 ug / plat confocale de Galt-PCP. Remarque: La quantité de plasmide utilisé dépendra de l&#39;efficacité de transfection. </li><li> Pour les lignes de cellules neuronales: Après l&#39;étape 1.4, dans une hotte de culture cellulaire, retirer les supports pré-transfection et différencier les cellules SN56 dans 2 ml DMEM supplémenté avec 0,1% de pénicilline / streptomycine avec 1 mM dibutyryl AMP cyclique (dbcAMP) pendant 24 heures. </li></ol> 2. Stade Microscope Préparation <ol><li> Préchauffer la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 37 ° C. Warm-up platine du microscope avant Imaging à 37 ° C. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS, enlever le support de différenciation et le remplacer par 2 ml de HBSS à 37 ° C. La place des cellules sur la platine du microscope chauffé à 37 ° C. Note: Les cellules sont viables pour environ 1,5-2 h dans HBSS. </li><li> Laisser 5-10 min à la température de la plaque confocal à équilibrer avec la platine du microscope. </li></ol> 3. Photo-activation de ROI plus de l&#39;appareil de Golgi <ol><li> Avec l&#39;oculaire du microscope, trouver des cellules transfectées avec GalT-PCP, LAMP1-mRFP et ßAPP-paGFP. <ol><li> Utilisez une lentille à immersion d&#39;huile avec un fort grossissement (c.-à-63X ou 100X). Pour une confirmation visuelle de la fluorescence, utiliser un filtre fixé capable de visualiser FITC (pour PCP et la fluorescence de GFP) et la rhodamine (pour mRFP fluorescence). </li></ol></li><li> Réglez la tranche confocale pour chaque canal à 1 um. Prenez une image basse résolution. </li><li> Crop à l&#39;image que la cellule d&#39;intérêt. </li><li> En utilisant le bouton de réglage, régler manuellementle plan focal au milieu de la cellule. Ceci est généralement la partie de la cellule dans laquelle le noyau est le plus grand. </li><li> Dessinez 3-5 Régions circulaires de Loisirs (ROI) dans le TGN (GalT-PCP fluorescence). <ol><li> Pour dessiner ROI (par exemple dans le programme Zeiss LSM), sélectionnez le bouton «Modifier ROI &#39;dans la console de commande. </li><li> Sélectionnez le bouton circulaire de ROI. </li><li> Cliquez et faites glisser sur GalT-PCP régions positifs de la cellule. Note: Les paquets photo-blanchiment pour de nombreux microscopes ont cette capacité. </li></ol></li><li> Prenez une image de la cellule avec le ROI superposée. Enregistrer une copie des ROI pour référence ultérieure. <ol><li> Pour sauver le ROI à l&#39;image, sélectionnez le bouton &quot;Macro&quot;. </li><li> Appuyez sur le bouton &#39;Load&#39; pour lancer le &#39;CopyRoisToOverlay »(Chemin du fichier: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb). Remarque: Un microscope confocal équipé de 475 à 525 nm (PCP) passe-bande (BP), un 500-530 nm BP (GFP),et un 560 nm longue passe (LP) jeux de filtres sont nécessaires. Un laser à argon à 458 nm et émission à 488 nm et un laser HeNe de 540 nm émission est également nécessaire. </li></ol></li><li> Mise en place du microscope pour un cours de temps de l&#39;eau de Javel. <ol><li> Régler la diode laser (25 mW 405 nm laser) pour une puissance maximale. Attention: la photo-activation excessive pourrait conduire à la photo-toxicité ou de dommages aux membranes cellulaires. Utilisez des lunettes de protection pour éviter d&#39;endommager la rétine. </li><li> Mise en place du microscope pour l&#39;imagerie de 120 cycles. Remarque: Un cycle d&#39;imagerie se compose de blanchiment dans le ROI et l&#39;imagerie de la cellule entière. Ceci est un cours de temps de l&#39;eau de Javel. </li><li> Réglez le microscope pour blanchir (photo-activation), seul le ROI pour les 20-30 itérations après chaque image. Le temps de l&#39;image et de l&#39;eau de Javel une image peut varier. Définir un temps de retard entre les images de sorte que chaque cycle est d&#39;environ 30 secondes. Remarque: La partie de l&#39;imagerie de chaque cycle dure environ 15-30 secondes, selon la taille de l&#39;image. Le blanchiment pour chaque ROI est d&#39;environ 50 ms. Blanchiment de tous les 4 ROI pour 20 itérations aura 4 sec à la fin de chaque cycle de Javel / d&#39;image. </li></ol></li><li> Commencez le cours du temps de l&#39;eau de Javel. </li><li> Éteignez le blanchiment après 15 min (30 cycles de l&#39;imagerie et de blanchiment), mais continuer à prendre des images de la cellule. Note: Temps de 0 à 15 min est la période «d&#39;impulsion». </li><li> Continuer la capture d&#39;images pendant 45 min (sans blanchiment), à suivre le jeu de la ßAPP-paGFP. Note: Temps de 15 à 45 min est la période &#39;Chase&#39;. </li><li> En utilisant la méthode d&#39;analyse décrite à l&#39;étape 6, co-localiser la protéine d&#39;intérêt (ici, ßAPP-paGFP) avec le compartiment d&#39;intérêt (ici, LAMP1-mRFP) en faisant surfaces à chaque canal. </li></ol> 4. Déterminer le compartiment aval <ol><li> Pour déterminer si les lysosomes (dans ces expériences) sont le dernier compartiment, ajouter des inhibiteurs de protease de membrane perméable à provoquer protéines d&#39;accumuler dans le lysosome.<ol><li> Pour ßAPP, utiliser 0,5 uM L685, 458 (inhibiteur de γ-secrétase spécifique) pendant la nuit ou 100 uM chloroquine (désacidifiante lysosomes) pendant 30 min avant l&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Trouver cellules et photoactiver comme dans l&#39;étape 3.1 à 3.8. </li><li> L&#39;image de la cellule pour un 45-minutes supplémentaires (sans photo-activation) pour déterminer où ßAPP-paGFP accumule en l&#39;absence de clivage. </li><li> Analyser la distribution de la protéine vers les lysosomes (ou autre compartiment aval) et de dégagement ultérieur selon le procédé décrit dans l&#39;étape 6. </li></ol> 5. assurer l&#39;exactitude de photo-activation dans l&#39;appareil de Golgi <ol><li> HBSS Warm-up à 37 ° C. </li><li> Préparer une solution à 2 ml, pour chaque plaque confocale à imager, de 66 uM nocodazole (traitement) ou le DMSO (témoin) dans HBSS. <ol><li> Pour une plaque confocale, une pipette 2 ml de 37 ° C HBSS et ajouter 7,96 pi de nocodazole d&#39;un nocodazole Stock 16.60 mm. </li><li> Comme un contrôle de sortelution, la pipette 2 ml de HBSS 37 ° C dans un tube de 2 ml et ajouter 7,96 ul de DMSO. </li></ol></li><li> Incuber les cellules dans HBSS avec nocodazole ou le DMSO pendant 5 min avant l&#39;imagerie. </li><li> Trouver cellules comme dans l&#39;étape 3.1. </li><li> Avant photoactivation, préparer le microscope pour prendre un Z-pile après la période photo-activation. <ol><li> Cliquez sur le bouton «Z Stack &#39;. Démarrez le balayage XY à l&#39;aide rapide. </li><li> Ajuster le plan focal avec le réglage du microscope bouton vers le haut de la cellule. Mark Première &#39;Appuyez sur pour régler la première position dans la pile. </li><li> Ajuster le plan focal avec le réglage du microscope bouton vers le bas (le plus proche du verre) de la cellule. Appuyez sur &#39;Mark Last&#39; de mettre la dernière position dans la pile. </li><li> Dans le panneau de la pile de Z, appuyez sur le bouton «Z sectionnement &#39;. Réglez le «Interval» à 1 pm. Remarque: Pour une meilleure résolution spatiale empiler un intervalle de pile plus petite, mais plus d&#39;images devrontêtre prises en allongeant la période d&#39;imagerie pour la pile. </li></ol></li><li> Blanchir les cellules, comme décrit à l&#39;étape 3/7 à 3/8. Photo-activation et de l&#39;image à partir de 0 min à 15 min (30 images). </li><li> Arrêtez imagerie après 30 images. Immédiatement enregistrer une image de la vidéo. Attention: Certains microscopes peuvent remplacer première vidéo si elle est pas sauvegardé avant de commencer une deuxième séquence d&#39;imagerie. </li><li> Après l&#39;enregistrement de la vidéo, d&#39;acquérir immédiatement un Z-pile, en utilisant les paramètres de l&#39;étape 5.5. </li><li> Co-localiser ßAPP-paGFP Galt-PCP (ou un autre marqueur de Golgi), comme décrit à l&#39;étape 6. Remarque: PCP photoblanchiment rapidement et peuvent ne pas être à la fin de la période de formation d&#39;image. Colocalisation peut ne pas être possible avec GalT-PCP. Si colocalisation est nécessaire, utiliser mRFP pour marquer GalT. </li></ol> 6. vésicules de filtrage et de colocalisation <ol><li> Utilisez un programme d&#39;analyse (par exemple Imaris) pour rendre les surfaces du compartiment (par exemple LAMP1-RDRF) et une protéine ointérêt de f (ex-ßAPP paGFP). </li><li> Entrez dans la section &#39;Surpass »du programme d&#39;analyse en cliquant sur le bouton Surpass sur la barre de menu du haut. </li><li> Sélectionnez le bouton de l&#39;assistant de surface au sommet de la plus panneau de gauche (5 e bouton à partir de la gauche). </li><li> Sélectionnez un canal pour filtrer vésicules (c.-à-ßAPP paGFP fluorescence, protéine d&#39;intérêt). </li><li> Effectuer soustraction de fond en soumettant le diamètre de la plus grande vésicule dans le domaine de l&#39;assistant et cliquez sur Suivant. Le programme d&#39;analyse sélectionne automatiquement - basé sur un seuil dérivé de la plus grande vésicule dans le domaine - un domaine dans le canal d&#39;intérêt. <ol><li> Ajuster manuellement le seuil de fond pour affiner la sélection si nécessaire. </li></ol></li><li> Au bas de l&#39;écran de sélection de seuil, vérifiez l&#39;option &#39;objets touchants Split pour séparer les surfaces combinée. Remarque: Si de nombreuses vésicules sont étroitement regroupés pourGuéter, le programme d&#39;analyse volonté de regrouper ces objets sous une surface. <ol><li> Choisissez 10-15 vésicules représentatifs et calculer le diamètre de la vésicule moyenne et entrez le résultat dans l&#39;assistant. </li></ol></li><li> Affiner les points de semences sélectionnées en augmentant ou diminuant le seuil sur la «qualité» (intensité du canal au milieu de chaque spot). Remarque: Les surfaces de la chaîne d&#39;intérêt seront créés. Affinement des surfaces sélectionnées peut être effectuée à ce stade. Vésicules de seuil sur la base du nombre de pixels dans chaque vésicule. </li><li> Masquer le canal original avec cette surface. Pour masquer, sélectionnez l&#39;onglet 4 de la gauche dans l&#39;assistant de création de surface (de crayon). </li><li> Sélectionnez &#39;Masque All&#39;. Un nouveau canal avec les vésicules d&#39;intérêt sera créé. Remarque: Durant le processus de masque, une option pour dupliquer le canal original est offert. Sélectionnez cette option si les données d&#39;origine a besoin d&#39;être sauvé. </li><li> Répétez sPTE 6.1 à 6.7 pour le canal non filtré (c.-à-LAMP1 mRFP, compartiment). </li><li> À la barre d&#39;outils supérieure, sélectionnez l&#39;outil de colocalisation. <ol><li> Dans le panneau supérieur, comme les histogrammes des canaux à colocalisés apparaissent, sélectionner les canaux masqués créés récemment. </li><li> Sélectionnez toutes les données disponibles. Il ya pixels sombres qui sont parfois présents après analyse. Ne sélectionnez pas ces pixels dans l&#39;histogramme, ils vont fausser les résultats. </li><li> Dans le panneau extrême droite, sélectionnez «Build Coloc Manche». Cela crée une nouvelle chaîne contenant uniquement les pixels colocalisés. Les données seront dans le même panneau sous le bouton «Statistiques Channel. Les données peuvent être exportées dans un fichier CSV. </li><li> Utilisez la statistique &#39;Pourcentage de matériel colocalisé&#39;. Cette option tient compte de l&#39;intensité des pixels et la taille de l&#39;objet. </li></ol></li></ol>

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T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).</li><li>Hailey, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+supply+membranes+for+autophagosome+biogenesis+during+starvation.">Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation.</a> Cell. 141 (4), 656-667 (2010).</li><li>Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Precursor+Protein+is+rapidly+transported+from+the+Golgi+apparatus+to+the+lysosome+and+where+it+is+processed+into+beta-amyloid.">The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid.</a> Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).</li><li>Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

Les auteurs ont aucun intérêt ou de conflits d&#39;intérêts financiers concurrents.

Cette technique décrit la photo-activation précise des protéines membranaires marqués avec paGFP dans le TGN pour visualiser le trafic et clivage subséquent. Alors que paGFP a été créée il ya une décennie 25, ceci est le premier exemple de photo-activation précise à suivre le trafic des protéines naissantes à compartiments aval. Des études antérieures utilisant APP-paGFP constructions photo-activé une région péri-nucléaire de la cellule, qui a été considéré comme l&#39;appareil de Golg...

La caractéristique de la maladie d&#39;Alzheimer (MA) est la présence de plaques séniles et les dégénérescences neurofibrillaires (NFT) de dans le cerveau. Le constituant majeur des plaques séniles est β-amyloïde (Aß). Aß est dérivé de son précurseur; protéine précurseur de l&#39;amyloïde (APP) 1. Le clivage de l&#39;APP amyloïdogène commence avec élimination de l&#39;ectodomaine de l&#39;APP par β-sécrétase 2. Le 99 résidus fragment terminal carboxyle restant (FCT) peut être clivée par γ-secrétase pour produire Aß 3-7. Bien que de nombreuses expériences ont démontré le clivage de l&#39;APP surface de la cellule après l&#39;internalisation de la surface de la cellule dans le système endosomique / lysosomique, un certain nombre d&#39;études récentes ont suggéré que le trafic intracellulaire de l&#39;APP est également important dans la régulation de son traitement 8-11. Il y a eu un certain nombre de tentatives de moduler les niveaux d&#39;Aß avec des inhibiteurs de y-sécrétase et d&#39;Aß immunotherapies. Cependant, de récents essais cliniques avec ces thérapies ont montré aucun avantage, et, dans certains cas, a causé un préjudice 12. Une stratégie inexploité pour moduler la production d&#39;Aß est de modifier la localisation sub-cellulaire de l&#39;APP et de l&#39;interaction γ-sécrétase. L&#39;appareil de Golgi, la membrane plasmique et les endosomes, lysosomes / ont tous été proposés comme lieux possibles de γ-clivage de l&#39;APP. Recherche dans notre laboratoire suggèrent que l&#39;APP et la γ-sécrétase sont des protéines résidentes de la membrane lysosomale 13. En outre, nous avons constaté que la lysosomales γ-sécrétase a un pH optimal acide 13. En outre, l&#39;alcalinisation du système endosomique / lysosomique par la chloroquine ou de NH 4 Cl, on a démontré à diminuer la production de Aß 14. y-sécrétase inhibition ou KO ou Presenilin conduit à l&#39;accumulation APP-FFC dans le lysosome 15-17. En outre, perturbant APP endocytose abaisse la production Aß 18-20. Malgré l&#39;importance de l&#39;appareil de Golgi comme une station de tri pour les protéines et les protéines recyclés à partir du système endosomal / lysosomale naissantes, le trafic intracellulaire de l&#39;APP n&#39;a pas été étudié en détail 21. Des travaux récents ont montré que l&#39;APP peut être recyclé dans le réseau trans-Golgi (TGN) via une interaction avec le complexe de rétromère. Régulation négative du complexe rétromère diminue la production d&#39;Aß 8,22-24. Cependant, la sortie de l&#39;APP de l&#39;appareil de Golgi n&#39;a pas été bien étudiée. En suivant l&#39;endocytose des protéines de surface cellulaire, tels que le récepteur de la transferrine, sont facilement marqué et suivi, suivant le trafic des protéines intracellulaires est plus difficile. En fait, peu de protéines ont eu leur trafic intracellulaire imagé. L&#39;avènement des étiquettes protéiques fluorescents, tels que les photo-activable-GFP (paGFP), a fourni de nouveaux outils pour étudier le trafic intracellulaire. Photo-activable-GFP est une forme de GFP qui est presque invisible après la synthèse, mais développe verte (GFP) une forte fluorescence après avoir été activé par la lumière laser de 413 nm, et ce signal est stable pendant des jours 25,26. Constructions utilisant paGFP ont été utilisées pour démontrer la traite intralysosomale de la protéine lysosomale protéine de la membrane 1 (LAMP1) 25, la livraison de la surface cellulaire de la de la stomatite vésiculaire Virus Glycoprotein (VSVG, un marqueur de la voie de sécrétion) 27, et le chiffre d&#39;affaires des peroxysomes 28 et 29 autophagosomes. Afin de visualiser le tri des APP à partir du TGN dans les cellules vivantes, nous avons conçu plasmide exprimant les derniers 112 acides aminés de APP couplés à photo-activable (paGFP) sur l&#39;extrémité C-terminale (ci-après paGFP-ßAPP) 30. Nous avons également procédé ces expériences avec pleine longueur APP et obtenu des résultats similaires; la construction de ßAPP est utilisé ici car il fournit des images plus lumineuses. Nous avons ensuite photo-activation et# 946; APP-paGFP seulement dans le TGN, identifié par le TGN marqueur galactosyltransférase (GalT). Bien que l&#39;APP a été étiqueté avec paGFP de visualiser le transport axonal rapide de l&#39;APP et de la clairance de la région périnucléaire, ceci est la première démonstration de l&#39;APP traite d&#39;un compartiment soigneusement définis pour une autre 11,31,32. Ici, nous démontrons précise photo-activation dans le TGN et la sortie de l&#39;APP en compartiments aval et ensuite clivage et la clairance de 30 lysosomes. Le photo-activation précise à l&#39;intérieur de l&#39;appareil de Golgi est largement applicable à d&#39;autres systèmes protéiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom culture dishes&#160;</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P-35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyrl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Microscopy stage insert P</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempcontrol 37&#8211;2 digital 2-channel</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 63&#215; 1.4 numerical aperture oil immersion lens&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L685, 458&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565771</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholorquine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628&#160;</td>
			<td>dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>with colocalization package&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

Bêta-amyloïde (Aß) est le constituant majeur des plaques séniles trouvés dans les cerveaux de patients atteints de la maladie d&#39;Alzheimer. Aß est dérivé du clivage séquentiel de la protéine précurseur amyloïde (APP) par β-sécrétase et y. Malgré l&#39;importance de Aß à AD pathologie, la localisation subcellulaire de ces clivages ne sont pas bien établie. Travaillent dans notre laboratoire et d&#39;autres impliquent le système endosomal / lysosomale dans la transformation d&#39;APP après internalisation de la surface de la cellule. Cependant, le trafic intracellulaire de l&#39;APP est relativement peu étudié. Bien protéines de surface cellulaire sont amendable à de nombreuses techniques de marquage, il n&#39;y a pas de méthodes simples pour suivre le trafic des protéines membranaires de l&#39;appareil de Golgi. À cette fin, nous avons créé des constructions d&#39;APP qui ont été marqués avec des photo-activable GFP (paGFP) à l&#39;extrémité C-terminale. Après synthèse, paGFP a une faible fluorescence basale, mais il peut être stimulé avec 413 nm lumière to produire une forte fluorescence verte, stable. En utilisant l&#39;appareil de Golgi marqueur Galactosyl transférase couplé à Cyan Fluorescent Protein (GalT-PCP) comme une cible, nous sommes en mesure de précision photoactiver APP dans le réseau trans-Golgi. Photo-activé APP-paGFP peut alors être suivie comme il trafique à compartiments aval identifiés par fluorescence protéines marquées marqueurs compartiment pour l&#39;endosome précoce (Rab5), l&#39;endosome tardif (Rab9) et le lysosome (LAMP1). En outre, l&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs de la transformation d&#39;APP, y compris la chloroquine ou la γ-sécrétase inhibiteur L685, 458, nous sommes en mesure de réaliser des expériences pulse-chase d&#39;examiner le traitement de l&#39;APP dans des cellules individuelles. Nous trouvons qu&#39;une grande partie de l&#39;APP se déplace rapidement vers le lysosome sans apparaissant à la surface de la cellule, et est ensuite éliminé du lysosome par clivages sécrétase. Cette technique démontre l&#39;utilité de paGFP pour suivre le trafic et le traitement des protéines intracellulaires from le Golgi à compartiments aval.

Les résultats typiques montrent ßAPP laissant le TGN et apparaît à la circulation rapidement à LAMP1 (figure 1a et b). Au cours de la période photo-activation, les vésicules peuvent être vus au départ l&#39;appareil de Golgi destiné à des lysosomes (figure 1b). Sans traitement inhibiteur, paGFP fluorescence sera visible dans les lysosomes alors qu&#39;il est photo-activation dans le TGN. Après l&#39;arrêt de photoactivation, la ßAPP-paGFP est rapidement éliminé du lysoso...

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Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Bien que le transport des protéines de la surface cellulaire est relativement facilement étudiée en visualisant le trafic des protéines intracellulaires est beaucoup plus difficile. Ici, nous utilisons des constructions incorporant GFP photoactivable et démontrons une méthode pour suivre avec précision la protéine précurseur de l&#39;amyloïde à partir de l&#39;appareil de Golgi à compartiments en aval et de suivre son jeu.

Imagerie du trafic intracellulaire de l&#39;APP avec la GFP photoactivable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

imaging-the-intracellular-trafficking-of-app-with-photoactivatable-gfp

Research

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Biology

11.7K vues.  Western University.  Bien que le transport des protéines de la surface cellulaire est relativement facilement étudiée en visualisant le trafic des protéines intracellulaires est beaucoup plus difficile. Ici, nous utilisons des constructions incorporant GFP photoactivable et démontrons une méthode pour suivre avec précision la protéine précurseur de l'amyloïde à partir de l'appareil de Golgi à compartiments en aval et de suivre son jeu. 