This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1. Cellule de placage et transfection <ol><li> Dans une hotte de culture cellulaire, plaque ~ 300.000 à ~ 500.000 SN56 cellules (une sorte cadeaux du Dr Jane Rylett) sur une boîte de 35 mm confocale à fond de verre et couvrir avec les médias pré-transfection (milieu Eagle modifié de Dulbecco, DMEM, complétée par 10% de FBS). </li><li> Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% à proliférer. Remarque: Les cellules doivent être d&#39;environ 50% -70% de confluence avant transfection. </li><li> Dans une hotte de culture de cellules, les cellules transfecter avec des plasmides exprimant une protéine fluorescente marqués marqueur TGN (Galactosyl transférase couplé à Cyan Fluorescent Protein, GalT-PCP), une protéine fluorescente étiqueté compartiment marqueur (ici, lysosome associated membrane protein 1, LAMP1, marqués avec mRFP), et la protéine d&#39;intérêt marqués avec paGFP (ßAPP-paGFP). (Ces constructions ont déjà été décrits 30) </li><li> Incuber les cellules avec un réactif de transfection et l&#39;ADN plasmidique fou 24 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Utiliser un rapport de ~ 2 pg d&#39;ADN de 5 pi d&#39;agent de transfection (par exemple, Lipofectamine 2000) à meilleur équilibre de la cytotoxicité et l&#39;efficacité de transfection. Peuvent avoir besoin d&#39;être optimisé pour différentes concentrations réelles plasmides. Dans les expériences décrites ici, utiliser 1 ug / plat confocale de ßAPP-paGFP, 0,3 pg / plat confocale de LAMP1-mRFP, et 0,2 ug / plat confocale de Galt-PCP. Remarque: La quantité de plasmide utilisé dépendra de l&#39;efficacité de transfection. </li><li> Pour les lignes de cellules neuronales: Après l&#39;étape 1.4, dans une hotte de culture cellulaire, retirer les supports pré-transfection et différencier les cellules SN56 dans 2 ml DMEM supplémenté avec 0,1% de pénicilline / streptomycine avec 1 mM dibutyryl AMP cyclique (dbcAMP) pendant 24 heures. </li></ol> 2. Stade Microscope Préparation <ol><li> Préchauffer la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 37 ° C. Warm-up platine du microscope avant Imaging à 37 ° C. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS, enlever le support de différenciation et le remplacer par 2 ml de HBSS à 37 ° C. La place des cellules sur la platine du microscope chauffé à 37 ° C. Note: Les cellules sont viables pour environ 1,5-2 h dans HBSS. </li><li> Laisser 5-10 min à la température de la plaque confocal à équilibrer avec la platine du microscope. </li></ol> 3. Photo-activation de ROI plus de l&#39;appareil de Golgi <ol><li> Avec l&#39;oculaire du microscope, trouver des cellules transfectées avec GalT-PCP, LAMP1-mRFP et ßAPP-paGFP. <ol><li> Utilisez une lentille à immersion d&#39;huile avec un fort grossissement (c.-à-63X ou 100X). Pour une confirmation visuelle de la fluorescence, utiliser un filtre fixé capable de visualiser FITC (pour PCP et la fluorescence de GFP) et la rhodamine (pour mRFP fluorescence). </li></ol></li><li> Réglez la tranche confocale pour chaque canal à 1 um. Prenez une image basse résolution. </li><li> Crop à l&#39;image que la cellule d&#39;intérêt. </li><li> En utilisant le bouton de réglage, régler manuellementle plan focal au milieu de la cellule. Ceci est généralement la partie de la cellule dans laquelle le noyau est le plus grand. </li><li> Dessinez 3-5 Régions circulaires de Loisirs (ROI) dans le TGN (GalT-PCP fluorescence). <ol><li> Pour dessiner ROI (par exemple dans le programme Zeiss LSM), sélectionnez le bouton «Modifier ROI &#39;dans la console de commande. </li><li> Sélectionnez le bouton circulaire de ROI. </li><li> Cliquez et faites glisser sur GalT-PCP régions positifs de la cellule. Note: Les paquets photo-blanchiment pour de nombreux microscopes ont cette capacité. </li></ol></li><li> Prenez une image de la cellule avec le ROI superposée. Enregistrer une copie des ROI pour référence ultérieure. <ol><li> Pour sauver le ROI à l&#39;image, sélectionnez le bouton &quot;Macro&quot;. </li><li> Appuyez sur le bouton &#39;Load&#39; pour lancer le &#39;CopyRoisToOverlay »(Chemin du fichier: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb). Remarque: Un microscope confocal équipé de 475 à 525 nm (PCP) passe-bande (BP), un 500-530 nm BP (GFP),et un 560 nm longue passe (LP) jeux de filtres sont nécessaires. Un laser à argon à 458 nm et émission à 488 nm et un laser HeNe de 540 nm émission est également nécessaire. </li></ol></li><li> Mise en place du microscope pour un cours de temps de l&#39;eau de Javel. <ol><li> Régler la diode laser (25 mW 405 nm laser) pour une puissance maximale. Attention: la photo-activation excessive pourrait conduire à la photo-toxicité ou de dommages aux membranes cellulaires. Utilisez des lunettes de protection pour éviter d&#39;endommager la rétine. </li><li> Mise en place du microscope pour l&#39;imagerie de 120 cycles. Remarque: Un cycle d&#39;imagerie se compose de blanchiment dans le ROI et l&#39;imagerie de la cellule entière. Ceci est un cours de temps de l&#39;eau de Javel. </li><li> Réglez le microscope pour blanchir (photo-activation), seul le ROI pour les 20-30 itérations après chaque image. Le temps de l&#39;image et de l&#39;eau de Javel une image peut varier. Définir un temps de retard entre les images de sorte que chaque cycle est d&#39;environ 30 secondes. Remarque: La partie de l&#39;imagerie de chaque cycle dure environ 15-30 secondes, selon la taille de l&#39;image. Le blanchiment pour chaque ROI est d&#39;environ 50 ms. Blanchiment de tous les 4 ROI pour 20 itérations aura 4 sec à la fin de chaque cycle de Javel / d&#39;image. </li></ol></li><li> Commencez le cours du temps de l&#39;eau de Javel. </li><li> Éteignez le blanchiment après 15 min (30 cycles de l&#39;imagerie et de blanchiment), mais continuer à prendre des images de la cellule. Note: Temps de 0 à 15 min est la période «d&#39;impulsion». </li><li> Continuer la capture d&#39;images pendant 45 min (sans blanchiment), à suivre le jeu de la ßAPP-paGFP. Note: Temps de 15 à 45 min est la période &#39;Chase&#39;. </li><li> En utilisant la méthode d&#39;analyse décrite à l&#39;étape 6, co-localiser la protéine d&#39;intérêt (ici, ßAPP-paGFP) avec le compartiment d&#39;intérêt (ici, LAMP1-mRFP) en faisant surfaces à chaque canal. </li></ol> 4. Déterminer le compartiment aval <ol><li> Pour déterminer si les lysosomes (dans ces expériences) sont le dernier compartiment, ajouter des inhibiteurs de protease de membrane perméable à provoquer protéines d&#39;accumuler dans le lysosome.<ol><li> Pour ßAPP, utiliser 0,5 uM L685, 458 (inhibiteur de γ-secrétase spécifique) pendant la nuit ou 100 uM chloroquine (désacidifiante lysosomes) pendant 30 min avant l&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Trouver cellules et photoactiver comme dans l&#39;étape 3.1 à 3.8. </li><li> L&#39;image de la cellule pour un 45-minutes supplémentaires (sans photo-activation) pour déterminer où ßAPP-paGFP accumule en l&#39;absence de clivage. </li><li> Analyser la distribution de la protéine vers les lysosomes (ou autre compartiment aval) et de dégagement ultérieur selon le procédé décrit dans l&#39;étape 6. </li></ol> 5. assurer l&#39;exactitude de photo-activation dans l&#39;appareil de Golgi <ol><li> HBSS Warm-up à 37 ° C. </li><li> Préparer une solution à 2 ml, pour chaque plaque confocale à imager, de 66 uM nocodazole (traitement) ou le DMSO (témoin) dans HBSS. <ol><li> Pour une plaque confocale, une pipette 2 ml de 37 ° C HBSS et ajouter 7,96 pi de nocodazole d&#39;un nocodazole Stock 16.60 mm. </li><li> Comme un contrôle de sortelution, la pipette 2 ml de HBSS 37 ° C dans un tube de 2 ml et ajouter 7,96 ul de DMSO. </li></ol></li><li> Incuber les cellules dans HBSS avec nocodazole ou le DMSO pendant 5 min avant l&#39;imagerie. </li><li> Trouver cellules comme dans l&#39;étape 3.1. </li><li> Avant photoactivation, préparer le microscope pour prendre un Z-pile après la période photo-activation. <ol><li> Cliquez sur le bouton «Z Stack &#39;. Démarrez le balayage XY à l&#39;aide rapide. </li><li> Ajuster le plan focal avec le réglage du microscope bouton vers le haut de la cellule. Mark Première &#39;Appuyez sur pour régler la première position dans la pile. </li><li> Ajuster le plan focal avec le réglage du microscope bouton vers le bas (le plus proche du verre) de la cellule. Appuyez sur &#39;Mark Last&#39; de mettre la dernière position dans la pile. </li><li> Dans le panneau de la pile de Z, appuyez sur le bouton «Z sectionnement &#39;. Réglez le «Interval» à 1 pm. Remarque: Pour une meilleure résolution spatiale empiler un intervalle de pile plus petite, mais plus d&#39;images devrontêtre prises en allongeant la période d&#39;imagerie pour la pile. </li></ol></li><li> Blanchir les cellules, comme décrit à l&#39;étape 3/7 à 3/8. Photo-activation et de l&#39;image à partir de 0 min à 15 min (30 images). </li><li> Arrêtez imagerie après 30 images. Immédiatement enregistrer une image de la vidéo. Attention: Certains microscopes peuvent remplacer première vidéo si elle est pas sauvegardé avant de commencer une deuxième séquence d&#39;imagerie. </li><li> Après l&#39;enregistrement de la vidéo, d&#39;acquérir immédiatement un Z-pile, en utilisant les paramètres de l&#39;étape 5.5. </li><li> Co-localiser ßAPP-paGFP Galt-PCP (ou un autre marqueur de Golgi), comme décrit à l&#39;étape 6. Remarque: PCP photoblanchiment rapidement et peuvent ne pas être à la fin de la période de formation d&#39;image. Colocalisation peut ne pas être possible avec GalT-PCP. Si colocalisation est nécessaire, utiliser mRFP pour marquer GalT. </li></ol> 6. vésicules de filtrage et de colocalisation <ol><li> Utilisez un programme d&#39;analyse (par exemple Imaris) pour rendre les surfaces du compartiment (par exemple LAMP1-RDRF) et une protéine ointérêt de f (ex-ßAPP paGFP). </li><li> Entrez dans la section &#39;Surpass »du programme d&#39;analyse en cliquant sur le bouton Surpass sur la barre de menu du haut. </li><li> Sélectionnez le bouton de l&#39;assistant de surface au sommet de la plus panneau de gauche (5 e bouton à partir de la gauche). </li><li> Sélectionnez un canal pour filtrer vésicules (c.-à-ßAPP paGFP fluorescence, protéine d&#39;intérêt). </li><li> Effectuer soustraction de fond en soumettant le diamètre de la plus grande vésicule dans le domaine de l&#39;assistant et cliquez sur Suivant. Le programme d&#39;analyse sélectionne automatiquement - basé sur un seuil dérivé de la plus grande vésicule dans le domaine - un domaine dans le canal d&#39;intérêt. <ol><li> Ajuster manuellement le seuil de fond pour affiner la sélection si nécessaire. </li></ol></li><li> Au bas de l&#39;écran de sélection de seuil, vérifiez l&#39;option &#39;objets touchants Split pour séparer les surfaces combinée. Remarque: Si de nombreuses vésicules sont étroitement regroupés pourGuéter, le programme d&#39;analyse volonté de regrouper ces objets sous une surface. <ol><li> Choisissez 10-15 vésicules représentatifs et calculer le diamètre de la vésicule moyenne et entrez le résultat dans l&#39;assistant. </li></ol></li><li> Affiner les points de semences sélectionnées en augmentant ou diminuant le seuil sur la «qualité» (intensité du canal au milieu de chaque spot). Remarque: Les surfaces de la chaîne d&#39;intérêt seront créés. Affinement des surfaces sélectionnées peut être effectuée à ce stade. Vésicules de seuil sur la base du nombre de pixels dans chaque vésicule. </li><li> Masquer le canal original avec cette surface. Pour masquer, sélectionnez l&#39;onglet 4 de la gauche dans l&#39;assistant de création de surface (de crayon). </li><li> Sélectionnez &#39;Masque All&#39;. Un nouveau canal avec les vésicules d&#39;intérêt sera créé. Remarque: Durant le processus de masque, une option pour dupliquer le canal original est offert. Sélectionnez cette option si les données d&#39;origine a besoin d&#39;être sauvé. </li><li> Répétez sPTE 6.1 à 6.7 pour le canal non filtré (c.-à-LAMP1 mRFP, compartiment). </li><li> À la barre d&#39;outils supérieure, sélectionnez l&#39;outil de colocalisation. <ol><li> Dans le panneau supérieur, comme les histogrammes des canaux à colocalisés apparaissent, sélectionner les canaux masqués créés récemment. </li><li> Sélectionnez toutes les données disponibles. Il ya pixels sombres qui sont parfois présents après analyse. Ne sélectionnez pas ces pixels dans l&#39;histogramme, ils vont fausser les résultats. </li><li> Dans le panneau extrême droite, sélectionnez «Build Coloc Manche». Cela crée une nouvelle chaîne contenant uniquement les pixels colocalisés. Les données seront dans le même panneau sous le bouton «Statistiques Channel. Les données peuvent être exportées dans un fichier CSV. </li><li> Utilisez la statistique &#39;Pourcentage de matériel colocalisé&#39;. Cette option tient compte de l&#39;intensité des pixels et la taille de l&#39;objet. </li></ol></li></ol>

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T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).</li><li>Hailey, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+supply+membranes+for+autophagosome+biogenesis+during+starvation.">Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation.</a> Cell. 141 (4), 656-667 (2010).</li><li>Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Precursor+Protein+is+rapidly+transported+from+the+Golgi+apparatus+to+the+lysosome+and+where+it+is+processed+into+beta-amyloid.">The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid.</a> Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).</li><li>Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

Les auteurs ont aucun intérêt ou de conflits d&#39;intérêts financiers concurrents.

Cette technique décrit la photo-activation précise des protéines membranaires marqués avec paGFP dans le TGN pour visualiser le trafic et clivage subséquent. Alors que paGFP a été créée il ya une décennie 25, ceci est le premier exemple de photo-activation précise à suivre le trafic des protéines naissantes à compartiments aval. Des études antérieures utilisant APP-paGFP constructions photo-activé une région péri-nucléaire de la cellule, qui a été considéré comme l&#39;appareil de Golg...

La caractéristique de la maladie d&#39;Alzheimer (MA) est la présence de plaques séniles et les dégénérescences neurofibrillaires (NFT) de dans le cerveau. Le constituant majeur des plaques séniles est β-amyloïde (Aß). Aß est dérivé de son précurseur; protéine précurseur de l&#39;amyloïde (APP) 1. Le clivage de l&#39;APP amyloïdogène commence avec élimination de l&#39;ectodomaine de l&#39;APP par β-sécrétase 2. Le 99 résidus fragment terminal carboxyle restant (FCT) peut être clivée par γ-secrétase pour produire Aß 3-7. Bien que de nombreuses expériences ont démontré le clivage de l&#39;APP surface de la cellule après l&#39;internalisation de la surface de la cellule dans le système endosomique / lysosomique, un certain nombre d&#39;études récentes ont suggéré que le trafic intracellulaire de l&#39;APP est également important dans la régulation de son traitement 8-11. Il y a eu un certain nombre de tentatives de moduler les niveaux d&#39;Aß avec des inhibiteurs de y-sécrétase et d&#39;Aß immunotherapies. Cependant, de récents essais cliniques avec ces thérapies ont montré aucun avantage, et, dans certains cas, a causé un préjudice 12. Une stratégie inexploité pour moduler la production d&#39;Aß est de modifier la localisation sub-cellulaire de l&#39;APP et de l&#39;interaction γ-sécrétase. L&#39;appareil de Golgi, la membrane plasmique et les endosomes, lysosomes / ont tous été proposés comme lieux possibles de γ-clivage de l&#39;APP. Recherche dans notre laboratoire suggèrent que l&#39;APP et la γ-sécrétase sont des protéines résidentes de la membrane lysosomale 13. En outre, nous avons constaté que la lysosomales γ-sécrétase a un pH optimal acide 13. En outre, l&#39;alcalinisation du système endosomique / lysosomique par la chloroquine ou de NH 4 Cl, on a démontré à diminuer la production de Aß 14. y-sécrétase inhibition ou KO ou Presenilin conduit à l&#39;accumulation APP-FFC dans le lysosome 15-17. En outre, perturbant APP endocytose abaisse la production Aß 18-20. Malgré l&#39;importance de l&#39;appareil de Golgi comme une station de tri pour les protéines et les protéines recyclés à partir du système endosomal / lysosomale naissantes, le trafic intracellulaire de l&#39;APP n&#39;a pas été étudié en détail 21. Des travaux récents ont montré que l&#39;APP peut être recyclé dans le réseau trans-Golgi (TGN) via une interaction avec le complexe de rétromère. Régulation négative du complexe rétromère diminue la production d&#39;Aß 8,22-24. Cependant, la sortie de l&#39;APP de l&#39;appareil de Golgi n&#39;a pas été bien étudiée. En suivant l&#39;endocytose des protéines de surface cellulaire, tels que le récepteur de la transferrine, sont facilement marqué et suivi, suivant le trafic des protéines intracellulaires est plus difficile. En fait, peu de protéines ont eu leur trafic intracellulaire imagé. L&#39;avènement des étiquettes protéiques fluorescents, tels que les photo-activable-GFP (paGFP), a fourni de nouveaux outils pour étudier le trafic intracellulaire. Photo-activable-GFP est une forme de GFP qui est presque invisible après la synthèse, mais développe verte (GFP) une forte fluorescence après avoir été activé par la lumière laser de 413 nm, et ce signal est stable pendant des jours 25,26. Constructions utilisant paGFP ont été utilisées pour démontrer la traite intralysosomale de la protéine lysosomale protéine de la membrane 1 (LAMP1) 25, la livraison de la surface cellulaire de la de la stomatite vésiculaire Virus Glycoprotein (VSVG, un marqueur de la voie de sécrétion) 27, et le chiffre d&#39;affaires des peroxysomes 28 et 29 autophagosomes. Afin de visualiser le tri des APP à partir du TGN dans les cellules vivantes, nous avons conçu plasmide exprimant les derniers 112 acides aminés de APP couplés à photo-activable (paGFP) sur l&#39;extrémité C-terminale (ci-après paGFP-ßAPP) 30. Nous avons également procédé ces expériences avec pleine longueur APP et obtenu des résultats similaires; la construction de ßAPP est utilisé ici car il fournit des images plus lumineuses. Nous avons ensuite photo-activation et# 946; APP-paGFP seulement dans le TGN, identifié par le TGN marqueur galactosyltransférase (GalT). Bien que l&#39;APP a été étiqueté avec paGFP de visualiser le transport axonal rapide de l&#39;APP et de la clairance de la région périnucléaire, ceci est la première démonstration de l&#39;APP traite d&#39;un compartiment soigneusement définis pour une autre 11,31,32. Ici, nous démontrons précise photo-activation dans le TGN et la sortie de l&#39;APP en compartiments aval et ensuite clivage et la clairance de 30 lysosomes. Le photo-activation précise à l&#39;intérieur de l&#39;appareil de Golgi est largement applicable à d&#39;autres systèmes protéiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom culture dishes&#160;</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P-35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyrl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Microscopy stage insert P</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempcontrol 37&#8211;2 digital 2-channel</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 63&#215; 1.4 numerical aperture oil immersion lens&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L685, 458&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565771</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholorquine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628&#160;</td>
			<td>dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>with colocalization package&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

Bêta-amyloïde (Aß) est le constituant majeur des plaques séniles trouvés dans les cerveaux de patients atteints de la maladie d&#39;Alzheimer. Aß est dérivé du clivage séquentiel de la protéine précurseur amyloïde (APP) par β-sécrétase et y. Malgré l&#39;importance de Aß à AD pathologie, la localisation subcellulaire de ces clivages ne sont pas bien établie. Travaillent dans notre laboratoire et d&#39;autres impliquent le système endosomal / lysosomale dans la transformation d&#39;APP après internalisation de la surface de la cellule. Cependant, le trafic intracellulaire de l&#39;APP est relativement peu étudié. Bien protéines de surface cellulaire sont amendable à de nombreuses techniques de marquage, il n&#39;y a pas de méthodes simples pour suivre le trafic des protéines membranaires de l&#39;appareil de Golgi. À cette fin, nous avons créé des constructions d&#39;APP qui ont été marqués avec des photo-activable GFP (paGFP) à l&#39;extrémité C-terminale. Après synthèse, paGFP a une faible fluorescence basale, mais il peut être stimulé avec 413 nm lumière to produire une forte fluorescence verte, stable. En utilisant l&#39;appareil de Golgi marqueur Galactosyl transférase couplé à Cyan Fluorescent Protein (GalT-PCP) comme une cible, nous sommes en mesure de précision photoactiver APP dans le réseau trans-Golgi. Photo-activé APP-paGFP peut alors être suivie comme il trafique à compartiments aval identifiés par fluorescence protéines marquées marqueurs compartiment pour l&#39;endosome précoce (Rab5), l&#39;endosome tardif (Rab9) et le lysosome (LAMP1). En outre, l&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs de la transformation d&#39;APP, y compris la chloroquine ou la γ-sécrétase inhibiteur L685, 458, nous sommes en mesure de réaliser des expériences pulse-chase d&#39;examiner le traitement de l&#39;APP dans des cellules individuelles. Nous trouvons qu&#39;une grande partie de l&#39;APP se déplace rapidement vers le lysosome sans apparaissant à la surface de la cellule, et est ensuite éliminé du lysosome par clivages sécrétase. Cette technique démontre l&#39;utilité de paGFP pour suivre le trafic et le traitement des protéines intracellulaires from le Golgi à compartiments aval.

Les résultats typiques montrent ßAPP laissant le TGN et apparaît à la circulation rapidement à LAMP1 (figure 1a et b). Au cours de la période photo-activation, les vésicules peuvent être vus au départ l&#39;appareil de Golgi destiné à des lysosomes (figure 1b). Sans traitement inhibiteur, paGFP fluorescence sera visible dans les lysosomes alors qu&#39;il est photo-activation dans le TGN. Après l&#39;arrêt de photoactivation, la ßAPP-paGFP est rapidement éliminé du lysoso...

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Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Bien que le transport des protéines de la surface cellulaire est relativement facilement étudiée en visualisant le trafic des protéines intracellulaires est beaucoup plus difficile. Ici, nous utilisons des constructions incorporant GFP photoactivable et démontrons une méthode pour suivre avec précision la protéine précurseur de l&#39;amyloïde à partir de l&#39;appareil de Golgi à compartiments en aval et de suivre son jeu.

Imagerie du trafic intracellulaire de l&#39;APP avec la GFP photoactivable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.7K vues.  Western University.  Bien que le transport des protéines de la surface cellulaire est relativement facilement étudiée en visualisant le trafic des protéines intracellulaires est beaucoup plus difficile. Ici, nous utilisons des constructions incorporant GFP photoactivable et démontrons une méthode pour suivre avec précision la protéine précurseur de l'amyloïde à partir de l'appareil de Golgi à compartiments en aval et de suivre son jeu. 

Vidéo: Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Étiquetage CSEh et hMSCs d&#39;oxyde de fer nanoparticules pour les non-invasives dans le suivi in ​​vivo avec IRM

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Recherche

Biologie

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Étiquetage des cellules souches avec des colorants fluorescents pour les non-invasive de détection avec l&#39;imagerie optique

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Imagerie fonctionnelle de la graisse brune chez les souris avec FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivez l&#39;imagerie des protéines GFP-étiquetés<em&gt; Drosophila</em&gt; Les ovocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopie intravitale pour l&#39;imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Le / GFP-FLP Méthode tomate / FRT pour l&#39;imagerie en direct de mosaïque adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; cellules photoréceptrices

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

Synthèse rapide et le dépistage de facteurs de transcription activés chimiquement avec Reporters base GFP

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Imagerie en temps réel des plantes Dynamics de surface cellulaire avec angle variable épifluorescence Microscopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.