Les analyses d’activité basées sur la NMR fournissent une méthode efficace pour identifier, évaluer et valider les inhibiteurs d’une enzyme donnée. Ils sont particulièrement bien adaptés pour le criblage des fragments. Les analyses NMR sont disponibles aux concentrations composées plus élevées requises pour les inhibiteurs plus faibles.
En outre, le manque d’enzymes reporter les rend moins sujettes aux faux positifs. Nous utilisons les analyses NMR dans notre laboratoire pour identifier et caractériser les inhibiteurs de deux enzymes de Trichomonas vaginalis. Les deux enzymes représentent de nouvelles cibles pour de nouveaux médicaments anti-trichomonaux.
Les analyses NMR sont généralement applicables à tout domaine de recherche qui implique des enzymes, et ils peuvent même être utilisés pour étudier les enzymes à l’intérieur des cellules. Les aspects les plus importants de la technique sont de s’assurer que les volumes corrects de réaccente sont pipetted et les composants de réaction sont complètement mélangés. Pour préparer le substrat et les composés d’essai, ajouter 12 microlitres de substrat à chacun des quatre tubes de microfuge de 1,5 millilitre et ajouter six microlitres de DMSO déréflé aux tubes de commande à zéro minute et de contrôle de 30 minutes.
Ajouter six microlitres du composé d’essai au premier tube expérimental et trois microlitres du composé d’essai et trois microlitres de DMSO stérilisé au deuxième tube expérimental. Ensuite, ajoutez 300 microlitres d’oxyde de deutérium à un tube de 15 millilitres contenant 2,59 millilitres de tampon de réaction, suivi de 25 microlitres de solution enzymatique. Inversez doucement le tube deux fois pour mélanger la solution de stock de réaction et ajoutez 10 microlitres de 1,5 acide chlorhydrique molaire à un tube de 1,5 millilitre contenant 582 microlitres de solution de stock de réaction.
Ensuite, transférez tout le volume de la solution de stock de réaction et de l’acide au tube de commande de zéro minute pour initier et étancher simultanément la réaction de commande de zéro minute. Aspirer et distribuer l’échantillon deux fois d’une manière lente mais délibérée. Initier et exécuter les trois réactions restantes de façon décalée, transférant immédiatement 582 microlitres de la solution de stock de réaction au premier tube expérimental et mélangeant l’échantillon deux fois comme il vient de le démontrer.
Une aspiration et une distribution minutieuses assurent un mélange complet pendant les étapes d’initiation. Soyez cohérent avec chaque échantillon pour vous assurer que le mélange différentiel n’est pas une variable. Après 30 secondes, transférer 582 microlitres de solution de stock de réaction au deuxième tube expérimental et mélanger, suivi de l’ajout de 582 autres microlitres de solution de stock de réaction au tube de commande de 30 minutes 30 secondes après le début de la réaction dans le deuxième tube expérimental.
Après 30 minutes, ajouter 10 microlitres d’acide chlorhydrique 1,5 molaire au premier tube expérimental, en répétant l’assaisissement à intervalles de 30 secondes pour les deuxièmes tubes de commande expérimentaux et de 30 minutes. Lorsque toutes les réactions ont été éteintes, transférer 600 microlitres de solution de chaque réaction aux tubes NMR. Calculer le pourcentage de conversion du substrat pour les spectres témoins, charger les échantillons sur le spectromètre, recueillir les spectres NMR et superposer les spectres pour les commandes de zéro et de 30 minutes.
Mettre à l’échelle le signal du substrat dans le contrôle de zéro minute pour correspondre au contrôle de 30 minutes et noter ce pourcentage. Ensuite, calculez la conversion en pourcentage comme 100 moins le pourcentage de l’appariement des signaux de substrat. Pour calculer la conversion en pourcentage du substrat pour les réactions contenant le composé d’essai, superposez les spectres pour le contrôle de zéro minute et la première réaction contenant le composé d’essai de 500 micromolaires et échellez le signal de substrat dans le contrôle de zéro minute pour correspondre au spectre avec le composé d’essai.
Notez ce pourcentage et utilisez-le pour calculer la conversion en pourcentage comme nous venons de le démontrer. Ensuite, superposez les spectres pour le contrôle de zéro minute et la première réaction contenant le composé d’essai de 250 micromolaires, et échellez le signal du substrat dans le contrôle de zéro minute pour correspondre au spectre avec le composé d’essai. Après avoir noté le pourcentage, utilisez-le pour calculer la conversion en pourcentage.
Pour calculer la réaction en pourcentage et l’inhibition en pourcentage pour chaque concentration composée d’essai, tout d’abord, calculer la réaction en pourcentage comme la conversion en pourcentage du composé d’essai, divisé par la conversion en pourcentage des temps de contrôle 100. Calculez ensuite l’inhibition en pourcentage comme 100 moins la réaction en pourcentage. Pour effectuer un essai de contre-écran détergent, ajoutez 300 microlitres d’oxyde de deutérium et 25 microlitres de solution enzymatique à un tube de 15 millilitres contenant 2,59 millilitres de tampon de réaction.
Inversez doucement le tube deux fois pour mélanger la solution de stock de réaction et ajoutez deux microlitres de détergent Triton X-100 à 20 millilitres de tampon de réaction. Ajoutez ensuite 2,59 millilitres de tampon de réaction, contenant 0,01 % de détergent Triton X-100 à un nouveau tube conique de 15 millilitres. Ajouter ensuite 300 microlitres d’oxyde de deutérium et 25 microlitres de solution enzymatique au tube.
Inversez doucement le tube deux fois pour mélanger la solution de stock de réaction. Ensuite, déterminez l’inhibition pour cent pour les composés d’essai de 100 micromolaires et de 50 micromolaires comme juste démontré. Utilisation de la solution de stock de réaction sans détergent, pour un ensemble de quatre tubes et la solution de stock de réaction avec détergent pour un deuxième ensemble de quatre tubes.
Pour effectuer une dilution de saut, transférez 468 microlitres de tampon de réaction et 60 microlitres d’oxyde de deutérium à un tube contenant 53,8 microlitres de tampon de réaction, cinq microlitres de solution enzymatique et 1,2 microlitres de DMSO qui incuberaient depuis 30 minutes. Aspirer et distribuer le mélange deux fois d’une manière lente, mais délibérée. Avant de transférer 468 microlitres de tampon de réaction et 60 microlitres d’oxyde de deutérium à un tube contenant 53,8 microlitres de tampon de réaction, cinq microlitres de solution enzymatique, et 1,2 microlitres de composé d’essai qui a été incuber pendant 30 minutes.
Mélanger la deuxième réaction deux fois comme démontré. Et transférez immédiatement 588 microlitres de solution du tube de commande DMSO jump-dilution à un tube contenant 12 microlitres de substrat avec mélange. Continuez à transférer 588 microlitres du tube composé d’essai de saut-dilution, du tube de commande non dilué de DMSO, et du tube composé d’essai non dilué à chacun des trois tubes de 1,5 millilitre, contenant 12 microlitres de substrat par tube avec mélange à intervalles de 30 secondes par la suite.
Ensuite, attendez 30 minutes avant d’étancher les réactions, la collecte des spectres NMR, et le calcul de l’inhibition pour cent pour chaque composé comme vient de le démontrer. Ici, les résultats pour tester deux composés contre AgNH dans un essai composé d’essai initial utilisant proton NMR comme démontré sont montrés. La réaction enzymatique est plus facilement observée et quantifiée par la disparition des résonances de singlet et de doublet d’adénosine à 8,48 et 6,09 parties par million respectivement.
Et l’apparition d’une résidence singlet adénoine à 8,33 parties par million comme on l’observe dans le spectre de contrôle de 30 minutes. Dans ce chiffre, les résultats pour tester un composé à deux concentrations contre AgNH dans un essai de contre-écran de détergent utilisant le proton NMR comme démontré sont montrés. Seules des différences minimales sont observées dans les intensités du substrat et les signaux du produit en utilisant les deux conditions, ce qui indique que l’inhibition enzymatique observée n’est pas un artefact de l’agrégation composée.
Notez que les résonances résultant du composé testé et du détergent n’interfèrent pas avec le substrat ou les résonances du produit. Les résultats pour l’essai d’un composé dans un essai de saut-dilution contre AGNH utilisant le proton NMR comme démontré indiquent une intensité réduite du signal de substrat dans la réaction de 20 micromolaires comparée à la réaction de 200 micromolaires, indiquant que l’inhibition est réversible. Un mélange complet de l’échantillon pendant l’initiation de chaque réaction et pour les dilutions de saut est critique.
Une aspiration et une dispense prudentes et cohérentes sont nécessaires. Les analyses à base de NMR peuvent également être utilisées pour mesurer l’activité enzymatique dans des cellules entières, à l’aide d’une solution contenant des cellules en suspension à la place du tampon de réaction et de l’enzyme. Nos efforts de découverte de médicaments anti-trichomonaux continuent de s’appuyer sur ces analyses pour mesurer la puissance des composés nouvellement synthétisés contre les enzymes ribohydrolase.
Même s’il n’est utilisé qu’en très petites quantités, l’acide chlorhydrique utilisé pour étancher les réactions est dangereux et doit être utilisé avec l’équipement de protection individuelle approprié.
