Le test des comètes est largement utilisé pour évaluer la génotoxicité. Notre protocole offre un certain nombre d’avantages méthodologiques par rapport au test standard des comètes. Notre technologie est centrée sur le maintien vertical des lames de comètes standard et leur traitement par lots de 25 dans un rack spécialement conçu.
Cela inclut l’électrophorèse, de sorte que le réservoir est plus petit, utilise moins de tampon et dispose d’un refroidissement intégré. Maintenus dans un rack, les gels délicats sur les lames sont plus protégés et passent d’une solution à l’autre en 25 secondes. En utilisant notre protocole de comète sanguine, les chercheurs peuvent utiliser une piqûre de sang pour étudier les dommages à l’ADN chez les humains, d’autres espèces et une grande variété d’expositions environnementales potentiellement génotoxiques.
Tous les différents formats pour le test cométaire qui utilisent des lames de microscope comme support solide pour les gels de comète sont adaptés à notre approche. La partie cruciale de cette technique consiste à charger des échantillons après mélange avec de l’agarose LMP. Les échantillons doivent être chargés rapidement sans faire de bulles et recouverts immédiatement d’un couvercle avant de se solidifier.
Pour commencer, préparez un point de fusion bas de 0,6% agarose dans du PBS et placez-le au bain-marie à 37 degrés Celsius. Étiquetez l’extrémité givrée des lames pré-enduites avec le nom, la date et les informations de traitement à l’aide d’un marqueur permanent ou d’un crayon. Placez une plaque de refroidissement sur un banc plat et insérez deux blocs réfrigérants congelés dans le tiroir coulissant sous la surface métallique.
Ensuite, placez les lames sur la plaque de refroidissement pour pré-refroidir pendant une à deux minutes. Centrifuger et retirer le surnageant des tubes d’échantillon et les remettre immédiatement sur la glace. Remettez en suspension la pastille de la cellule avec 200 microlitres d’agarose à bas point de fusion à 0,6% et mélangez par pipetage.
Ensuite, ajoutez 80 microlitres de cellules contenant de l’agarose sur une lame réfrigérée et placez rapidement un couvercle sur le gel. Laisser le gel prendre sur la plaque de refroidissement pendant une à deux minutes. En attendant, préparez 500 millilitres de solution de travail de tampon de lyse et versez-la dans le plat de lyse.
Une fois les gels pris, retirez rapidement les feuillets de couverture en maintenant doucement la lame entre le pouce et l’index et en faisant glisser le couvercle hors du gel. Ensuite, placez les diapositives à l’intérieur d’un support de diapositive avec toutes les marques de points noirs sur les diapositives orientées dans la même direction. Placez le support de glissière à l’intérieur de l’antenne de lyse.
Fermez le couvercle de la boîte de lyse et mettez-le pour l’incubation. Retirez délicatement le support de glissière de la boîte de lyse sans déranger les gels. Placez délicatement le support de glissière dans un plat de lavage préchargé d’eau glacée à double distillation.
Assurez-vous que les diapositives sont complètement immergées et quittez la configuration pendant 30 minutes. Placez un pack de refroidissement congelé sous le réservoir d’électrophorèse pour maintenir une température tampon optimale. Ensuite, ajoutez une solution de travail d’électrophorèse glacée au réservoir et transférez-y le support de glissière.
Orientez les lames de manière à ce que les gels contenant des cellules pointent vers la cathode. Incuber les lames dans le réservoir d’électrophorèse pendant 20 minutes pour permettre à l’ADN de se détendre. Ensuite, allumez l’alimentation pour effectuer une électrophorèse pendant 20 minutes à 1,19 volts par centimètre.
Une fois l’électrophorèse terminée, coupez l’alimentation et retirez le support de glissière du réservoir d’électrophorèse. Laissez le support de glissière s’égoutter sur du papier de soie pendant 30 secondes. Ensuite, placez le support de glissière dans un plat contenant un tampon de neutralisation et laissez-le pendant 20 minutes.
Ensuite, placez-le dans un plat de lavage contenant de l’eau glacée à double distillation et laissez-le pendant 20 minutes. Après le lavage, retirez le support de glissière de l’eau et laissez les lames sécher dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pour réhydrater les lames, transférer le support de glissière dans un plat de lavage contenant de l’eau glacée à double distillation et laisser reposer 30 minutes.
Ensuite, placez le support de lame dans un plat de coloration contenant 2,5 microgrammes par millilitre de solution d’iodure de propidium. Fermez le couvercle du plat de coloration et incuberez-le pendant 20 minutes à l’obscurité à température ambiante. Après l’incubation, transférez le support de lame dans un plat séparé et lavez-le avec de l’eau glacée à double distillation pendant 20 minutes.
Retirez le support de glissière de la capsule et séchez-le complètement dans l’obscurité, soit dans un incubateur à 37 degrés Celsius, soit à température ambiante. Une fois les lames complètement sèches, stockez-les dans une boîte de diapositives dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’analyse de l’image. Les kératinocytes humains ont été irradiés avec différentes doses d’UVA et d’UVB ou traités avec du peroxyde d’hydrogène de 50 micromolaires pour induire des dommages à l’ADN.
La tension optimale était de 1,19 volts centimètre, car elle induit la réponse la plus sensible et le plus grand pourcentage d’ADN de queue. Le sang total humain a été irradié avec différentes doses d’UVA et traité avec différentes concentrations de Fpg. Le test de comètes alcalines à haut débit a révélé que les niveaux optimaux de dommages à l’ADN ont été induits avec quatre unités par millilitre de Fpg.
La lignée cellulaire de cancer de l’ovaire SK-OV-3 a été traitée avec une combinaison de cisplatine et de peroxyde d’hydrogène. Les cellules non exposées n’ont montré aucun dommage. L’exposition au peroxyde d’hydrogène seul a généré un moment moyen significatif de la queue d’olive par rapport aux cellules dans lesquelles des liaisons croisées intrabrin d’ADN ont été induites.
Après un traitement avec du cisplatine 100 micromolaires, les réticulations intrabrin d’ADN ont augmenté avec un pic à 12 heures, après quoi les niveaux ont diminué à zéro après 30 heures Il est essentiel de mettre le sac de glace dans le réservoir d’électrophorèse et d’incuber les lames pendant 20 minutes pour dérouler l’ADN avant l’électrophorèse. Cette étape aidera l’ADN endommagé à voyager par courant. L’exécution du test avec des lames placées verticalement nous a permis d’automatiser le test de la comète.
De plus, notre technique a simplifié le test des comètes pour la recherche.
