Ce travail a été en charge principalement par 5 UO1-ES016045 avec le soutien partiel de 1-R21-R44-ES019498 et ES021116. DMW a été soutenu par la subvention de formation NIEHS en toxicologie environnementale T32-ES007020. Matériel a été fourni par le Centre de sciences de la santé de l&#39;environnement P30-ES002109.

1 Préparation de puce <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retirer le gel de la puce de son emballage et placez dans un côté du film d&#39;un seul puits plaque rectangulaire, gel vers le bas. </li><li> Laver gel dans 25 ml 1x PBS pendant 15 min, répéter deux fois. </li><li> Réglez gel sur plaque de verre et l&#39;étiquette orientation de gel en conséquence. </li><li> Appuyez doucement sur une plaque de 96 puits sans fond inversé sur le gel; assurez-vous que tous les puits de la plaque de puits sans fond sont dans la zone du gel. </li><li> Utiliser 1,5 &#39;&#39; des clips liants sur chaque côté de la plaque de serrage pour fixer avec le verre. </li><li> Aspirer excès tampon PBS dans chaque puits. </li></ol> 2. cellules de chargement <ol style="margin-left: 40px;"><li> Préparer des suspensions cellulaires: <ol><li> Pour les lignées cellulaires en suspension, diluer la suspension de cellules dans un milieu pour obtenir une concentration finale de 10 5 -10 6 cellules / ml. </li><li> Pour les lignées cellulaires adhérentes, suivre les protocoles normaux de séparation / trypsinisation et dILUTE cellules détachées dans un milieu à une concentration finale de 10 5 -10 6 cellules / ml. Si les cellules s&#39;agrègent, passer suspension de cellules dans un filtre cellulaire pour obtenir une suspension de cellules isolées. </li></ol></li><li> Ajouter 100 ul de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 96 puits. </li><li> Couvrir la plaque avec le film de gel pour éviter l&#39;évaporation des médias. </li><li> Permettent aux cellules de charge pendant au moins 30 min à 37 ° C incubateur. </li><li> Retirer puce de médias de l&#39;incubateur et aspirer chaque puits. </li><li> Retirer des clips liant et plaque de 96 puits sans fond; tenir la puce avec la plaque de verre à un angle et rincer doucement avec 1x PBS pour éliminer les cellules excédentaires sur agarose. </li><li> Vérifiez cellule chargement à l&#39;aide d&#39;un microscope à champ lumineux avec un objectif 4X. Si le chargement insuffisante est observée, recommencer depuis l&#39;étape 2.1. </li><li> Placez puce chargée sur une surface plane (table de laboratoire). Puce superposition avec 1% à bas point de fusion (LMP) agarose qui est pré-chauffé à 37 ° C. Utiliser environ 2̵1, 3 ml d&#39;agarose LMP est nécessaire pour chaque puce. </li><li> Laisser recouvrement se solidifier abord à température ambiante pendant 3 min, puis passer à 4 ° C réfrigérateur pendant 5 min pour la gélification complète. </li></ol> 3. de dosage et de réparation REMARQUE: Pour étudier base du niveau de dommages à l&#39;ADN, passez à l&#39;étape 4. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Aligner soigneusement les puits de la puce (créé à partir de serrage précédent) avec les puits d&#39;une nouvelle plaque de 96 puits sans fond. Re-appuyez sur la plaque de 96 puits sans fond sur serrage supérieure et sécurisé avec des clips de liant. </li><li> Ajouter 100 ul de dose souhaitée de produit chimique dans chaque puits de la plaque à 96 puits; réaliser le dosage / traitement sur de la glace ou à 4 ° C pour réfrigérateur quantité désirée de temps. </li><li> Après le dosage, les produits chimiques aspirer de chaque puits et rincer les résidus chimiques utilisant 1x PBS. Si les dommages directs sont étudiés ici, passez à l&#39;étape 4. </li><li> Pour étudier la cinétique de réparation, permettre aux cellules dans la puce de réparer enmédias à 37 ° C. Lyse (passez à l&#39;étape 4) à des moments spécifiques. REMARQUE: La réparation peut être effectuée sur la puce avec une plaque 96 puits sans fond attachée, ou de la puce peut être découpée en morceaux séparés après le retrait de la plaque à 96 puits sans fond. </li></ol> 4. Lysis <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pour effectuer test des comètes alcaline: <ol><li> Faire de travail du tampon de lyse alcaline par addition de 1% de Triton X-100 à la lyse alcaline solution mère (2,5 M de NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10 mM de Tris, pH 10). Préparer environ 25 ml de travailler tampon de lyse pour chaque puce. </li><li> Pré-froid travailler tampon de lyse alcaline à 4 ° C. </li><li> Immerger puce dans un tampon de lyse alcaline fraîche de travail et permet d&#39;effectuer la lyse O / N 4 ° C dans un réfrigérateur. </li></ol></li><li> Pour effectuer test des comètes neutre: <ol><li> Faire travailler tampon de lyse neutre en ajoutant 1% de Triton X-100 et 10% de DMSO à neutre solution lyse des stocks (2,5 M de NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10mM de Tris, 1% de N -Lauroylsarcosine, pH 9,5). Préparer environ 25 ml de travail du tampon de lyse pour chaque puce. </li><li> Préchauffer travailler tampon de lyse neutre à 43 ° C. </li><li> Immerger puce dans un tampon de lyse chaud neutre de travail et permet d&#39;effectuer la lyse O / N en 43 ° C incubateur. </li></ol></li></ol> 5. électrophorèse <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pour effectuer test des comètes alcaline: <ol><li> Retirez un tampon de lyse et rapidement rincer puce 1x PBS. </li><li> Puce sécurisée dans une chambre d&#39;électrophorèse avec le côté film de gel vers le bas à l&#39;aide du ruban adhésif double-face. </li><li> Amener la chambre à 4 ° C une chambre froide. </li><li> Remplir la chambre avec un tampon alcalin d&#39;électrophorèse froid (0,3 M de NaOH, 1 mM Na 2 EDTA) à un niveau qui couvre seulement le gel. </li><li> Permettre le déroulement alcaline pendant 40 min. </li><li> Exécuter une électrophorèse à 1 V / cm et 300 mA pendant 30 minutes dans la chambre froide. Réglez le volume de tampon d&#39;électrophorèse dans la chambre de réaliser courant de croisière souhaitée. </li></ol></li><li> Pour effectuer test des comètes neutre: <ol><li> Retirer le tampon de lyse et rincer la puce avec du tampon d&#39;électrophorèse neutre (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM de Tris, d&#39;acide borique 90 mM, pH 8,5) pendant 2 x 15 min à 4 ° C. </li><li> Puce sécurisée dans une chambre d&#39;électrophorèse avec le côté film de gel vers le bas à l&#39;aide du ruban adhésif double-face. </li><li> Amener la chambre à 4 ° C une chambre froide. </li><li> Remplir la chambre avec un tampon d&#39;électrophorèse neutre froid (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM de Tris, 90 mM acide borique, un pH de 8,5) à un niveau qui couvre seulement le gel. </li><li> Laisser le gel de s&#39;asseoir dans une chambre froide pendant 60 min. </li><li> Exécuter une électrophorèse à 0,6 V / cm et 6 mA pendant 60 minutes dans la chambre froide. Ajuster le volume de tampon d&#39;électrophorèse dans la chambre à atteindre le courant de fonctionnement désiré. </li></ol></li></ol> 6. imagerie fluorescente <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retirez la puce de la chambre d&#39;électrophorèse de cold ambiante. </li><li> Neutraliser les gels dans un tampon de neutralisation (0,4 M Tris, pH 7,5) pour 2 x 15 min dans 4 ° C réfrigérateur. </li><li> Colorer la puce avec fluorescent colorant ADN de choix (c&#39;est-à-SYBR Or, le bromure d&#39;éthidium) sous l&#39;usine procédures recommandées. Image en utilisant la microscopie à fluorescence. </li></ol> Analyse 7. données Analyser Images de comètes par le logiciel de test des comètes standard tel que Komet 5.5.

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The CometChip has been licensed to Trevigen, Inc. based upon a patent submission that includes Wood, Weingeist, Bhatia and Engelward.

Génotoxines omniprésents dans l&#39;environnement et aussi à l&#39;intérieur des cellules humaines exercent stress inévitable et les dommages à l&#39;ADN cellulaire. En fait, il a été estimé qu&#39;il existe 1,000s des lésions de l&#39;ADN présent dans les cellules humaines à l&#39;état stationnaire 18. Comprendre dommages sensibilité et la cinétique de réparation chez l&#39;homme apporte non seulement un aperçu de la recherche fondamentale, mais bénéficie également du développement de médicaments. Ironiquement, malgré la possibilité de dommages à l&#39;ADN pour favoriser le cancer, les agents endommageant l&#39;ADN sont utilisées à des niveaux très élevés pour traiter le cancer, faire la connaissance de dommages à l&#39;ADN et la réparation liées à la médecine personnalisée. Le CometChip est un dispositif qui utilise la nouvelle recherche pratiques de microfabrication de révolutionner un dosage de dommages à l&#39;ADN long existé. S&#39;appuyant sur les mêmes principes de l&#39;essai de comète traditionnelle, la puce offre un débit nettement plus élevé et une meilleure reproductibilité. Nous décrivons ici les méthodes d&#39;utilisation de cette puce. Pour clarifier son utilité et de robustesse, nous montrons des résultats vientm plusieurs expériences où la puce a été utilisé pour évaluer les dommages induits par plusieurs agents endommageant l&#39;ADN différents, et où il a été utilisé pour évaluer réparation de l&#39;ADN. Ensemble, les résultats présentés ici fournissent des informations utiles pour l&#39;utilisation de la puce et de démontrer son large champ d&#39;application de la recherche sur les lésions de l&#39;ADN et la réparation. L&#39;une des étapes les plus importantes de ce protocole est d&#39;accomplir le chargement efficace des cellules. De nombreuses lignées cellulaires ont été testés sur ce système, y compris à la fois la suspension et des cellules adhérentes. Chargement efficacité dépend de nombreuses variables telles que le type de cellules, la taille des cellules, de la concentration et du temps de chargement. lignées de cellules en suspension telles que les cellules lymphoblastoïdes sont les plus faciles à travailler avec. La concentration de la suspension de cellules peut varier de 10 4 à 10 6 cellules par 96 puits et le chargement terminé habituellement en 15 à 30 min. Densité cellulaire plus élevée facilite le chargement et réduit la quantité de temps nécessaire pour que les cellules sédimenter dans les micropuits. paramètres de charge pour les cellules adhérentes peuvent différer des cellules en suspension. Des lignées cellulaires telles que l&#39;ovaire de hamster chinois (CHO), se sont révélés avoir une efficacité de chargement similaire à celui de cellules en suspension (suite de la trypsine) et en utilisant les conditions de chargement similaires ainsi. D&#39;autres types de cellules, comme les cellules tumorales qui forment facilement des agrégats de cellules en suspension, nécessitent un traitement supplémentaire. Passe suspensions cellulaires à travers un filtre à une seule cellule et l&#39;addition de trypsine au support de suspension peut supprimer la formation de groupes de cellules lors du chargement. Enfin, en termes de temps de chargement, le temps nécessaire pour la capture des lignées de cellules adhérentes dans des micropuits peut varier de 20 min à 1 h. En conséquence, il est recommandé aux utilisateurs d&#39;effectuer des expériences pilotes pour déterminer les conditions optimales de chargement avant de procéder à d&#39;autres investigations. Chargement efficacité peut être visualisé sous un microscope en champ lumineux ou plus précisément révélé par coloration des cellules encapsulées avec DAPI ou un autre ADNtaches antérieures à l&#39;évaluation dans le cadre du microscope à fluorescence. Un avantage majeur de cette méthode et de la puce est la polyvalence. Premièrement, les chercheurs ne sont pas limités à une concentration spécifique de cellules de travail parce que les cellules excédentaires sont emportées, et la puce assure uniforme comète densité. Ensuite, les puits peuvent être réalisés avec des tailles variables pour tenir compte de formats différents types de cellules. Dans des circonstances que plusieurs cellules sont capturées en une seule cupule, comètes multi-cellulaires sont les résultats de l&#39;auto-calibré et de rendement cohérents par rapport aux comètes unicellulaires 6,7. Un autre avantage de motif sur un micro-réseau dans des cellules est que les comètes sont alors dans le même plan focal à des positions fixes, à réduire le bruit dû à des comètes floues et de faciliter l&#39;imagerie et l&#39;analyse automatisée. Les améliorations significatives de débit et fournies par la sensibilité CometChip permettent l&#39;application de l&#39;essai pour des études de grande échelle. Dans l&#39;ensemble, la puce fournitsa outil précieux pour l&#39;évaluation des dommages de l&#39;ADN pour les chercheurs, des toxicologues, des cliniciens et des épidémiologistes. Alors que le test des comètes est connu pour son excellente sensibilité dans la détection d&#39;un large éventail de lésions de l&#39;ADN, ce test souffre également d&#39;une faible spécificité. L&#39;utilisation de ce protocole permet d&#39;améliorer considérablement le rendement et la reproductibilité de l&#39;essai, mais ne prouve pas l&#39;avancement de la spécificité. Néanmoins, le dosage de multiplexage avec d&#39;autres méthodes ont été rapportés pour être efficace pour atteindre une plus grande spécificité. Un exemple est l&#39;inclusion d&#39;enzymes spécifiques de lésions purifiés. Ces enzymes peuvent convertir des lésions de base autrement indétectables dans ruptures de brins détectables et les sites abasiques 1,19-21. Un exemple largement utilisé est la réparation endonucléase formamidopyrimidine-ADN glycosylase (FPG), qui révèle modifications de l&#39;ADN de l&#39;oxydation 19,22. Étant donné que l&#39;étape de digestion enzymatique est appliquée après la lyse cellulaire, le système peut être traité de la même manière unsa lame de agarose traditionnel sans modifications au protocole. Bien que le protocole détaillé n&#39;est pas décrit ici, cette approche a été adaptée par de nombreux utilisateurs de test des comètes traditionnelles dans le passé et les protocoles peut être facilement trouvé. Dans une publication précédente, nous avons utilisé cette méthode pour identifier les dommages induits par la lumière fluorescente 22. L&#39;avantage majeur de cette méthode est le débit qu&#39;il fournit, ce qui ouvre la porte à des études qui étaient auparavant presque impossible. La capacité de traiter 96 échantillons sur la même plate-forme non seulement de réduire la main-d&#39;œuvre et de temps, mais réduit également les bruits expérimentaux et améliore considérablement la reproductibilité. Inter variation de l&#39;échantillon est nettement plus faible que la variation traditionnel coulisseau à glissière, qui peut être deux fois plus élevée que la variation observée avec cette puce 6,7. Réduction du bruit conduit également à une meilleure sensibilité, permettant de détecter des différences plus subtiles entre les échantillons. Parce que le dispositif utilise un standard format de 96 puits, il est compatible avec les équipements de recherche générale et HTS technologies. Envisager une étude qui nécessite une évaluation de 100 échantillons, en supposant qu&#39;un chercheur moyenne peut traiter ~ 30 lames de verre au cours de plusieurs jours. Étant donné que chaque échantillon doit être effectuée trois fois, il faudrait environ un mois pour terminer une telle étude, qui serait également subir inévitablement de l&#39;échantillon à la variation de l&#39;échantillon. En revanche, le traitement de 100 conditions, chacun en trois exemplaires, avec cette puce ne nécessite que quelques plaques et peuvent être effectuées en trois jours. Cette amélioration importante du débit ouvre la porte à des études qui étaient auparavant inaccessibles. Le protocole présenté ici décrit à la fois les procédures de base pour la réalisation du test comète norme et les étapes modifiés nécessaires pour utiliser la plate-forme de CometChip. Avec la possibilité de mesurer à la fois inhérents niveaux de dommages à l&#39;ADN et la réponse de réparation ultérieure, le dosage est très pertinente pourun grand nombre d&#39;applications biologiques et cliniques. Informations sur l&#39;impact des expositions aux produits chimiques spécifiques sur le génome facilite la prévention et le traitement des maladies. En outre, il ya également un intérêt important dans la détermination des variations de dommages à l&#39;ADN sensibilité et la capacité de réparation chez les personnes 23,24. Cette technique fournit le débit nécessaire pour ces études à grande échelle. La connaissance des variations inter-individuelles est essentielle pour identifier les personnes sensibles et au développement de thérapies individualisées ou des stratégies de préventions. Pris dans leur ensemble, la technologie présentée ici fournit un haut débit, dommages à l&#39;ADN objective et quantitative plate-forme d&#39;analyse qui a le potentiel de devenir une méthode standard dans un avenir proche.

L&#39;électrophorèse sur gel de cellule unique (SCGE) test (aka le test des comètes) est une technique largement utilisée pour la quantification d&#39;un large spectre de lésions de l&#39;ADN, y compris les lésions de base, les sites abasiques, cassures simple brin, des cassures double brin, des liaisons transversales et alcali sensible sites. Le principe sous-jacent de l&#39;essai est que l&#39;ADN endommagé migre plus facilement que l&#39;ADN endommagé en raison de la fragmentation et de la perte de la structure superhélicoïdale. L&#39;étendue de la migration est proportionnelle à la quantité de lésions de l&#39;ADN, et peut être visualisée en utilisant la microscopie de fluorescence. Capture d&#39;image et l&#39;analyse du profil d&#39;intensité de l&#39;ADN en forme de comète individuel offrent alors des mesures de paramètres tels que la longueur de la queue, la queue moment, et l&#39;ADN% en queue de révéler le niveau de dommages à l&#39;ADN dans une cellule 1-4. Actuellement, il existe deux versions couramment utilisées de l&#39;essai de comète: a) test comète alcaline et b) dosage comète neutre. Le test des comètes alcalin est le plus largementversion utilisée, qui utilise un tampon à pH élevé pour se détendre avant électrophorèse ADN et donc détecte tous les types de cassures de brins et des sites sensibles aux alcalis. Le test des comètes neutre, d&#39;autre part, est inférieur pratiqué car il utilise un tampon neutre à maintenir les hélices doubles et de détecter seulement des cassures double brin de 2,5. Pour les agents chimiques et physiques qui induisent CDB, BSN sont créés de concert, et sont formés à des niveaux beaucoup plus élevés (par exemple, BSN γIR-induites sont un ordre de grandeur plus commun que CDB). Pour la plupart des expositions endommageant l&#39;ADN, CSD sont beaucoup moins fréquentes que les autres catégories de dommages de l&#39;ADN, et sont donc plus difficiles à détecter. Nous avons démontré dans des publications antérieures de la fenêtre de détection de deux versions 6,7. Bien que le test des comètes a été régulièrement utilisé pour la recherche fondamentale sur les lésions de l&#39;ADN et la réparation et de la génotoxicité des tests 1,2,8-15, le test a été déclaré avoir une mauvaise reproductibilité de l&#39;échantillon à-to-échantillon, de personne à personne et de la variabilité du laboratoire à la laboratoire. En outre, le dosage est faible débit, en partie parce que l&#39;acquisition d&#39;images et l&#39;analyse de données sont laborieux. Ensemble, ces limitations contribuent à son acceptation relativement faible dans les études à grande échelle. Grâce à l&#39;intégration de technologies et de principes d&#39;ingénierie, la CometChip apporte une solution aux problèmes de débit et les incohérences qui sont associés à l&#39;essai de comète traditionnelle 6,7. En bref, pour créer la puce, un moule est microfabriqué en utilisant la photolithographie pour créer des micro-messages ayant des diamètres aussi petits que celui d&#39;une cellule unique. Le moule est ensuite utilisé pour emboutir sur agarose fondu, résultant en une matrice de micro-puits après la solidification du gel. Les puces sont développées pour fournir aux chercheurs des puits de taille variable pour compatible avec différents types de cellules. Pour charger la puce, les cellules dans les médias sont autorisés à s&#39;installer dans les puits de gravité; les cellules excédentaires sont emportés. Cellules piégés sont ensuite encapsulés nousment une mince couche de bas point de fusion d&#39;agarose, et une plaque de 96 puits sans fond est ensuite serré à la surface du gel de créer 96 macrowells, chacune avec des centaines de micro-puits sur sa surface inférieure. Ce protocole décrit les procédures générales pour les expériences avec cette puce, qui comprennent la préparation du gel, la cellule de chargement, de dosage et de réparation, la lyse des cellules, l&#39;électrophorèse, et l&#39;imagerie de fluorescence. Nous démontrons deux exemples d&#39;expériences de dose-réponse avec des cellules lymphoblastiques exposées agents endommageant l&#39;ADN connu, en utilisant des versions neutres et alcalins de l&#39;essai, respectivement. Deux expériences de réparation sont également présentés pour décrire comment la réponse de réparation post-exposition peut être évaluée à l&#39;aide du système.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">UltraPure LMP Agarose (low melting point)</td>
			<td style="width:129px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16520</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td style="width:129px;">Gibco by life technologies</td>
			<td style="width:101px;">14190</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7581-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Na2EDTA</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">4931-04</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (base)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (acid)</td>
			<td style="width:129px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:101px;">4106</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline N-lauroylsarcosine</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L9150</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">X100</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D4540</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaOH</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7708-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">BDH3871</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline boric acid</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B6768</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Equipments</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">CometChip</td>
			<td style="width:129px;">Trevigen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1-well dish</td>
			<td style="width:129px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:101px;">73521-420</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bottomless 96-wel plate</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">655000-06</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5&#8243; binder clips</td>
			<td style="width:129px;">Staples</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass plate</td>
			<td style="width:129px;">Tag Hardware</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Customized to size of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Owl Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">27372-131</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:101px;">164-5050</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cometchip: a high-throughput 96-well platform for measuring dna damage in microarrayed human cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

Dans ce premier exemple, nous décrivons l&#39;approche pour quantifier les niveaux initiaux de dommages à l&#39;ADN dans les cellules lymphoblastoïdes humaines après une exposition à des dommages oxydatifs à l&#39;aide de H 2 O 2. Afin d&#39;évaluer H 2 O 2 induites par des lésions de base et cassures simple brin, les conditions de comètes alcalines sont utilisées. Après le chargement est terminé et les cellules ont été encapsulé avec la superposition d&#39;agarose, une plaque de 96 puits sans fond est pressée sur la surface pour créer 96 compartiments sur la puce. Chacun des 96 puits peuvent être dosés avec un type ou la concentration de produits chimiques différents. Ici quatre doses différentes de H 2 O 2 et ont été utilisés 1x PBS a été utilisé comme contrôle négatif. Des images représentatives de comètes déployées sont présentés dans la figure 1A, en cas de non-traitée (en haut), 50 uM (au milieu) et 100 uM (en bas) H 2 O 2 -exposed échantillons ont montré des niveaux différents de la queue des comètes. Analyse des images de la comète peut être performed en utilisant un logiciel disponible dans le commerce, ce qui permet de quantifier globalement des niveaux de dommages sur la base de la distance totale de l&#39;intensité de fluorescence et de la migration de chaque queue de comète. Les mesures sont généralement effectuées sur 50 à 100 comètes par l&#39;état et la valeur médiane (soit% de l&#39;ADN de queue ou de la longueur de la queue) est calculée. Figure 1B illustre la courbe de réponse de l&#39;ADN pourcentage de queue analysé des comètes de cellules lymphoblastoïdes TK6 exposées à quatre concentrations différentes de H 2 O 2. La cohérence entre les expériences indépendantes démontre l&#39;efficacité de cette approche dans l&#39;évaluation des dommages à l&#39;ADN réponse de différents niveaux de traitements chimiques dans les cellules. Pour en savoir plus sur la variation entre les échantillons (par exemple, entre macrowells) et entre des répétitions de la même expérience, entre l&#39;échantillon et la variabilité inter-expérimental a été tracée sur la figure 2A et 2B respectivement. Dans chaque expérience, chaque puits de la 96-wpuce ell est équivalent à un échantillon différent et donc la variation du puits à bien révèle l&#39;inter-échantillon variante du dispositif. Ici, les cellules TK6 chargés dans les puits 12 de la puce 96 puits ont été traitées avec la même dose de H 2 O 2 et lysées immédiatement après le traitement. Toutes les autres étapes expérimentales ont été effectuées en parallèle et les médianes d&#39;au moins 50 comètes de chaque macrowell ont été tracées sur la figure 2A. La moyenne des valeurs médianes est de 77,53% de l&#39;ADN dans la queue, avec un écart type est de 3,99%. A partir de ces données, on calcule que le coefficient de variation entre les échantillons est de 5,2%, ce qui est plusieurs fois plus faible que le test traditionnel, ce qui démontre l&#39;amélioration de la robustesse de ce dosage 6,16. Pour en apprendre davantage sur la reproductibilité de l&#39;analyse, nous avons exposé les cellules TK6 dans une puce avec 75 uM H 2 O 2 et d&#39;analyser le niveau immédiat de dommages à l&#39;ADN. Cette expérience a été répétée six fois et les données de chaque expérience a été tracée en Figure 2B. Dans des conditions expérimentales identiques, nous avons obtenu des résultats allant de 41,76% à 57,87%, présentée comme barres grises dans la figure. La moyenne de six répétitions est de 49,57%, avec une erreur type de la moyenne de seulement 2,04%. La faible variation entre les répétitions implique que le test des comètes effectuées sur ce nouveau dispositif est hautement reproductible. Pour évaluer la cinétique de réparation, les cellules sont autorisés à réparer leur ADN dans un milieu frais après le traitement. Lyse macrowells à différents points dans le temps indique la variation de dommages à l&#39;ADN au cours du temps. Un exemple est montré sur la figure 3. Dans cette expérience, les cellules ont d&#39;abord été TK6 encapsulés dans la puce, traitées avec 50 uM de H 2 O 2, et on les laisse à réparer jusqu&#39;à 60 min après l&#39;exposition. Les cellules ont été lysées à 0, 20, 45 et 60 min respectivement. Comète images représentatives de différents points dans le temps sont représentées sur la figure 3A, et la variation des niveaux d&#39;endommagement de l&#39;ADN au cours du temps est tracée sur la figure3B. Ces données ont révélé que la quasi-totalité des dommages sont réparés dans les 45 minutes après H 2 O 2 traitement. De nombreuses variables peuvent influencer le taux de réparation, y compris le type de ligne de la cellule et de l&#39;agent chimique utilisé. Ainsi les chercheurs peuvent apporter des modifications au protocole (par exemple, l&#39;extension du temps de réparation) pour s&#39;adapter à des besoins supplémentaires dans leurs enquêtes. Ici, nous offrons un autre exemple de l&#39;expérience de réparation à l&#39;aide de cette puce, dans laquelle les cellules TK6 sont mis au défi avec un autre génotoxique N-méthyl-N &#39;-Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG) est un agent alkylant connu pour induire des lésions de base, y compris 7-méthylguanine et 3-méthyladénine. Ces lésions sont convertis avecBASIC sites les plus visités par dépurination spontanée ou par l&#39;élimination enzymatique par glycosylases d&#39;ADN. Le site abasique obtenu peut être clivé dans des conditions alcalines et, par conséquent détecté sur la puce. L&#39;exposition initiale provoque une augmentation significative des dommages, évident à partir de la longuequeue, et au fil du temps ces queues sont réduits comme les cellules de restaurer l&#39;ADN intact lors de la réparation. Bien que l&#39;alkylation et les dommages oxydatifs sont tous deux principalement réparées par la voie de réparation par excision de base et la quantité de lésions générées et les protéines impliquées dans la réparation varient. Ces variations peuvent conduire à des taux de conversion avecBASIC sites, ainsi que des taux de réparation des sites de abasiques résultant. Dans la Figure 4, la cinétique de réparation de cellules TK6 exposés à 0,1, 1 et 3 ug / ml de MNNG sont présentés. Dans cette expérience, nous avons étendu le temps de l&#39;expérience à 2 heures après l&#39;exposition parce que les dommages MNNG induite semble persister plus longtemps et est effacé à un rythme plus lent par rapport à H 2 O 2 induite par les dommages. Analyse des CDB dans des conditions neutres est très similaire au protocole pour l&#39;analyse des lésions simple brin en utilisant les conditions alcalines. Pour montrer l&#39;ampleur des dégâts initiaux, TK6 ont été exposés à des niveaux variables de Gir,<html> et les cellules résultantes ont été lysées et soumis à une électrophorèse à un pH neutre (figure 5A). Il est à noter que la morphologie de la queue de comète est différente des conditions d&#39;essai alcalins. Pour obtenir l&#39;ADN fragmenté observable en utilisant ce dosage, la dose IR utilisé est nettement plus élevée (de 0 à 100 Gy) à la dose nécessaire pour voir des dégâts dans les conditions alcalines. En outre, nous avons constaté que la longueur de la queue est le paramètre le plus sensible pour refléter le degré de dommages à l&#39;ADN en utilisant le test des comètes neutre 7. La courbe dose-réponse de l&#39;analyse est représenté sur la figure 5B. Réparation de l&#39;ADN des cassures double brin dans les cellules peut également être évaluée, et a été montré par Weingeist et. al. 7. Dans l&#39;ensemble, la CometChip neutre offre un outil précieux pour l&#39;analyse à haut débit de l&#39;ADN CDB. 1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figure 1. H 2 O 2 dose réponse des cellules TK6 utilisant test des comètes alcaline. (A) comètes de microplaques Rangée de lymphoblastes non traités TK6 (en haut) et les cellules TK6 exposées à 50 uM (au milieu) et 100 uM (en bas) H 2 O 2 pendant 20 min à 4 ° C. La barre d&#39;échelle est de 100 um. (B) H 2 O 2 en réponse à la dose de cellules TK6 exposées à différents niveaux de H 2 O 2. Chaque point de données représente la moyenne de trois expériences indépendantes, où le pourcentage médian queue ADN d&#39;au moins 50 comètes individuels ont été obtenus dans chaque expérience. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;erreur standard de la moyenne de trois expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Inter-échantillon et l&#39;Inter-expérimentale variabilité. (A) variation échantillon à échantillon. cellules lymphoblastiques humaines TK6 ont été chargés dans les puits 12 de la puce 96 puits. Chaque puits a été exposé à 100 ul de 50 uM de H 2 O 2 pendant 20 min à 4 ° C. Les cellules ont été lysées immédiatement et analysé l&#39;ADN% de la queue. Les données de chaque puits est montré ici. Chaque boîte représente la médiane au moins 50 comètes individuelles de chaque puits. Le moyen de 12 puits est 77,53%, l&#39;écart type est de 3,99%, et le coefficient de variation est calculé à 5,2%. (B) variation expérience à l&#39;expérience. cellules lymphoblastiques humaines TK6 ont été chargés dans la puce de 96 puits, sont exposés à 100 ul de 75 uM de H 2 O 2 pendant 20 min à 4 ° C. Les cellules ont été lysées immédiatement et analysé l&#39;ADN% de la queue.La même expérience a été répétée six fois et les données de chaque répétition est représentée par une barre grise. Chaque boîte représente la médiane% queue ADN d&#39;au moins 100 comètes individuelles de chaque répétition. La moyenne de 6 répétitions est de 49,57%, présentée comme la barre de revenir ici. L&#39;écart-type de 6 répétitions est de 4,99%, et l&#39;erreur-type de la moyenne est calculée comme étant de 2,04%, représentée comme la barre d&#39;erreur dans la figure. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3. Réparation de H 2 O 2 induite par des dommages dans les lymphoblastes TK6. (A) Schéma de l&#39;étude de la réparation avec des comètes représentatives. TK6 sont traités avec des agents nocifs et autorisés à réparer dans les médias à 37 ° C avant la lyse. (B) la cinétique de réparation des cellules TK6 après traitement avec 50 uM H 2 O 2 pendant 20 min à 4 &amp; #176; C. Chaque point de données représente la moyenne de trois expériences indépendantes, où le pourcentage médian queue ADN d&#39;au moins 50 comètes individuels ont été obtenus dans chaque expérience. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;erreur standard de la moyenne des expériences répétitives. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4. Réparation des dommages MNNG-induite dans les lymphoblastes TK6. TK6 sont traités avec 0,1, 1 et 3 pg / MNNG ml pendant 30 min à 4 ° C et doit être réparé dans les médias à 37 ° C jusqu&#39;à 120 min après exposition. Le pourcentage moyen de l&#39;ADN de queue d&#39;au moins 50 comètes individuelles ont été obtenues pour chacun des trois expériences indépendantes. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;erreur-typede la moyenne de trois expériences indépendantes. <img alt="Figure 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" width="300" /> Figure 5. Dose-réponse IR des cellules TK6 utilisant test des comètes neutre. (A) Parée microplaques comètes de lymphoblastes non traités TK6 (en haut) et les cellules TK6 exposées à 40 Gy (au milieu) et 80 Gy (en bas) irradiation gamma. La barre d&#39;échelle est de 100 um. Réponse à la dose (B) IR de cellules TK6 exposées à différents niveaux d&#39;irradiation gamma. Chaque point de données représente la longueur de la queue médian (um) d&#39;au moins 300 comètes regroupées de six macrowells sur la puce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Nous décrivons ici une plate-forme qui permet la détection de test des comètes de dommages à l&#39;ADN avec un débit sans précédent. Les motifs de dispositif de cellules de mammifères dans une puce et permet le traitement parallèle de 96 échantillons. L&#39;approche facilite l&#39;analyse des lésions de l&#39;ADN au niveau de base, les dommages à l&#39;ADN induits exposition et réparation de l&#39;ADN cinétique.

CometChip: Une plate-forme à haut débit de 96 puits pour la mesure de dommages de l&#39;ADN dans les cellules humaines Microarrayed

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

cometchip-high-throughput-96-well-platform-for-measuring-dna-damage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K vues.  Massachusetts Institute of Technology.  Nous décrivons ici une plate-forme qui permet la détection de test des comètes de dommages à l'ADN avec un débit sans précédent. Les motifs de dispositif de cellules de mammifères dans une puce et permet le traitement parallèle de 96 échantillons. L'approche facilite l'analyse des lésions de l'ADN au niveau de base, les dommages à l'ADN induits exposition et réparation de l'ADN cinétique. 

Vidéo: CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcapsules d&#39;alginate comme une plate-forme 3D pour la Propagation et différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à différentes lignées

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Recherche

Bio-ingénierie

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

Plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles du sang entier non transformé

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Utilisation Tomoauto: Un protocole pour la tomographie à haut débit automatisé cryo-électronique

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Utilisation du haut débit MICROBIOREACTEUR système automatisé pour la Production d’IgG1 de modèle dans les cellules CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Phénottypage à haute teneur en levures avec séquençage à base d’ARN à base de gouttelette

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Développement de tissu cardiaque humain organisé en 3D au sein d’une plate-forme microfluidique

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...