La co-immunodécision multiplexée quantitative, ou QMI, permet aux utilisateurs de mesurer simultanément des centaines d’interactions binaires dans un réseau prédéfini d’interaction protéique. En effectuant plusieurs co-ADRESSES IP simultanément dans le même lysate, les techniques de bioinformatique peuvent ensuite examiner comment les groupes de co-associations changent de manière coordonnée. L’analyse prend beaucoup de temps à se développer, mais une fois que le panneau QMI est en main, des données à l’échelle du réseau peuvent être recueillies au sujet des systèmes de transduction de signaux dans un essai relativement simple du jour au lendemain.
QMI exige le tuyautage précis de différents échantillons et réachemages dans 96 plaques de puits. Des notes prudentes doivent être prises lors de la mise en place et de l’exécution de chaque analyse pour éviter les erreurs. Pour la préparation de l’échantillon et l’immunoprécipitation, commencez par lyser l’échantillon dans un détergent approprié avec des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase pendant une incubation de 15 minutes sur la glace.
À la fin de l’incubation, faites tourner l’échantillon pour enlever les membranes et les débris et effectuez un essai de BCA sur le surnatant pour déterminer la concentration de protéines selon les protocoles standard. Après avoir normalisé les concentrations de protéines, préparer un mélange magnétique maître perle qui contient environ 250 perles magnétiques de chaque classe par puits. Utilisez la séparation magnétique pour laver le mélange de perles magnétiques deux fois dans le tampon Fly P avant de réutiliser les perles dans 20 microlitres de tampon Fly P par échantillon.
Après un tuyautage complet, aliquot 20 microlitres de perles dans un tube de microcentrifugeuse glacée par échantillon et ajouter des volumes égaux de lysate avec des concentrations de protéines normalisées à chaque tube pour l’immunoprécipitation. Ensuite, divisez chaque échantillon de lysate en un seul tube pour chaque plaque en cours d’exécuter et immunoprécipita les échantillons sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit à l’abri de la lumière. Le lendemain matin, utilisez une grille à perles magnétiques pour enlever le lysate du premier ensemble de tubes et laver les perles deux fois dans 500 microlitres de tampon fly p froid par lavage.
Après avoir calculé le volume de resuspension, resuspendez les immunoprécipices dans le volume calculé de tampon fly p froid de glace. Resuspendez soigneusement les perles magnétiques par pipetting doux et distribuez 25 microlitres de perles par puits à travers une plaque plate de puits de 96 fond sur la glace. Dans une autre plaque de puits de 96, diluer par des anticorps de sonde attinilated à une concentration de travail de deux fois.
Utilisez une pipette multicanal pour distribuer 25 microlitres de chaque dilution d’anticorps de sonde dans les puits appropriés de la perle magnétique contenant la plaque d’essai et secouer à grande vitesse sur un shaker horizontal de plaque pour mélanger et résuspendre les perles magnétiques. Après le mélange, réduire la vitesse pendant une incubation d’une heure à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver la plaque trois fois avec un tampon Fly P frais par lavage sur une laveuse à plaque magnétique à quatre degrés Celsius.
Après le dernier lavage, resuspendre les perles dans 50 microlitres de streptavidine PE dilué un à 200 dans fly p tampon. Agiter le mélange et réutiliser les perles avant d’incuber la plaque à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez la plaque trois fois avec le tampon Fly P sur une laveuse à plaque magnétique à quatre degrés Celsius et réutilisez les perles dans 125 microlitres de tampon Fly P.
Secouez la plaque pendant une minute à 900 rotations pour bien résuspendre les perles et charger la plaque dans un cytomètre d’écoulement reridgerated. Dans le logiciel de cytomètre d’écoulement, sélectionnez réglage haute cible RP1, un état d’arrêt de 1000 perles par région, et un volume d’échantillon de 80 microlitres. Mettez la course en pause à mi-parcours et réutilisez les perles pour éviter de les régler.
À la fin de la course, exportez les fichiers de données dans le format XML. Pour effectuer l’analyse anc, remplissez le fichier d’entrée anc pour refléter les détails de la conception expérimentale et exécutez le programme, qui va écrire un fichier CSV dans le répertoire actif. Le fichier se terminant par des hits.
csv signalera les co-associations protéiques significativement différentes à un niveau faussement positif de 0,05 entre les conditions de contrôle et expérimentales dans au moins trois des quatre répliques expérimentales. Pour l’analyse du réseau de corrélation pondérée, coller les titres de colonne de la sortie du fichier de données par Matlab se terminant en mfi. csv dans la première colonne d’une nouvelle feuille de calcul et ajouter les colonnes Expérience pour le numéro d’expérience et le traitement pour le traitement expérimental et toutes les autres variables à analyser.
Enregistrez ce fichier sous forme de traits. csv et ouvrir R Studio. Réglez l’annuaire de travail dans un dossier contenant le mfi.
csv et traits. csv fichiers, mettre en surbrillance des sections de code, et appuyez sur Commandez entrer pour exécuter les commandes R comme indiqué dans le fichier de commande commenté. Les modules d’analyse réseau de corrélation pondérés significativement corrélés avec chaque trait expérimental seront la sortie en tant que fichier graphique et la corrélation de chaque interaction avec chaque module sera sortie comme un fichier CSV.
Pour chaque interaction dans le fichier de sortie ANC, déterminez si cette interaction est également significative par l’AIIC et créez une nouvelle colonne qui indique si chaque coup de l’ANC est également un succès de l’AIIC. Convertissez les valeurs en deux fois le changement et calculez la valeur moyenne pour tous les succès de l’ANC union CNA. Enfin, faire une nouvelle feuille de calcul avec chaque syndicat ANC CNA frappé répertorié par sa cible d’immunoprécipitation dans une colonne, sa cible de sonde dans la deuxième colonne, et sa valeur de changement de pli dans la troisième colonne.
Importez ce fichier dans Cytoscape en tant que réseau pour créer un diagramme de bord de nœud. Les interactions protéiques à haute confiance identifiées par les deux approches statistiques indépendantes sont visualisées sous forme de diagrammes de bord de nœud à l’aide du logiciel open source, Cytoscape, ou sous forme de cartes thermiques utilisant le code R et les instructions d’analyse incluses dans le matériau supplémentaire. Tout au long du protocole, les utilisateurs doivent prendre soin de pipette avec précision, de garder des dossiers méticuleux, et de garder les échantillons froids en tout temps.
Nous avons utilisé QMI pour comprendre comment les voies de transduction du signal différencient les différents types d’entrée et intègrent l’information provenant de récepteurs multiples.
