Cette méthode permet d’étudier les formations de complexes protéiques qui nécessitent une co-expression pour des échantillons de test efficaces, tels que la formation d’hétérodimères. Le principal potentiel final de cette méthode est d’exploiter la co-expression de protéines étudiées marquées différentiellement en utilisant des combinaisons de vecteurs compatibles pour promouvoir un assemblage complexe efficace, ainsi qu’un flux de travail et une évolutivité rapides permettant des tests patch rapides de multiples interactions. Cette méthode peut également être utilisée pour le dépistage rapide des conditions optimales d’expression et de purification des protéines.
La démonstration visuelle permet d’effectuer correctement les étapes critiques du protocole, telles que la configuration de la co-expression, la perturbation des cellules et les étapes de retrait ultérieures. Pour commencer, cultivez la souche Escherichia coli BL21(DE3) dans un milieu Luria-Bertani, ou LB, à 37 degrés Celsius jusqu’à une densité optique, ou OD, de 0,1 à 0,2. Centrifuger un millilitre de suspension bactérienne pendant une minute à 9 000 G à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant.
Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de tampon de transformation glacé, ou TB, et incuber pendant 10 minutes sur de la glace. À la fin de l’incubation, centrifuger pendant 30 secondes à 8 000 g à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon TB, 100 nanogrammes de chaque vecteur et incuber pendant 30 minutes sur de la glace.
Chauffer à 42 degrés Celsius pendant 150 secondes, puis refroidir sur la glace pendant une minute. Ensuite, ajoutez un millilitre de média LB sans antibiotiques et incuber à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes. Après incubation, centrifuger et remettre en suspension la pastille dans 100 microlitres de milieu LB avant de plaquer la suspension sur une plaque de gélose LB contenant 0,5% de glucose et les antibiotiques correspondants.
Incuber l’assiette pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, rincer les cellules de la plaque avec deux millilitres de média LB dans 50 millilitres de média LB avec les antibiotiques correspondants. Ajoutez des ions métalliques ou d’autres cofacteurs connus avant de stocker une partie aliquote contenant du glycérol à 20 % à moins 70 degrés Celsius pour des expériences ultérieures.
Cultiver les cellules avec une rotation constante de 220 RPM à 37 degrés Celsius à une OD de 0,5 à 0,7. Refroidir la culture à température ambiante et ajouter IPTG à une concentration finale d’un millimole. Conserver une partie aliquote de 20 microlitres de suspension cellulaire comme témoin de l’échantillon non induit.
Incuber les cellules pendant la nuit à 220 RPM à 18 degrés Celsius. Le lendemain, divisez la suspension bactérienne en deux parties et stockez des aliquotes de 20 microlitres pour confirmer l’expression des protéines. Centrifuger la suspension cellulaire restante à 4 000 G pendant 15 minutes.
Pour le test pulldown, remettre les granulés en suspension dans un millilitre de tampon de lyse glacée avec des inhibiteurs de protéase et des agents réducteurs ajoutés immédiatement avant l’expérience. Ajustez la composition tampon pour les protéines testées. Perturbez les cellules par sonication sur de la glace et stockez une partie aliquote de 20 microlitres pour l’électrophorèse.
Centrifuger à 16 000 G pendant 30 minutes et recueillir 20 microlitres du lysat clarifié pour l’électrophorèse. Équilibrer la résine avec un millilitre de tampon de lyse glacée pendant 10 minutes, puis centrifuger à 2 000 G pendant 30 secondes et jeter le surnageant. Ajouter des lysats cellulaires à la résine et incuber pendant 10 minutes à une rotation constante de 15 RPM.
Ensuite, centrifuger et jeter le surnageant avant de recueillir 20 microlitres de la fraction non liée pour analyse. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de lavage glacé et incuber pendant une minute. Encore une fois, centrifugez et jetez le surnageant.
Ensuite, effectuez deux longs lavages avec un tampon de lavage glacé. Après le deuxième lavage, éluer les protéines liées avec 50 microlitres de tampon d’élution dans un agitateur à 1 200 tr / min à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Analyser les protéines éluées avec l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS.
Des études sur le domaine associé aux doigts de zinc, ou ZAD, l’homo-dimérisation dans la protéine de liaison au maltose, ou MBP, et les tests 6xHistidine pulldown sont présentées ici. La co-expression des ZAD fusionnés MBP et Thiorédoxine 6xHistidine montre une activité d’homodimérisation bonne et reproductible, apparaissant comme une bande supplémentaire dans les résultats SDS-PAGE du test de pulldown MBP. Un autre exemple d’utilisation de la méthode pour étudier la formation complexe alternative est montré ici.
Dans le test de co-expression, ENY2 marqué 6xHistidine a interagi à la fois avec Sgf11 marqué GST et MBP-CTCF, mais aucun GST-Sgf11 n’était présent dans les pulldowns MBP et vice-versa. Une comparaison étape par étape des intervalles de temps requis dans le flux de travail du test pulldown conventionnel par rapport au pulldown couplé à la co-expression est présentée ici. Les résultats de l’utilisation des deux techniques pour étudier la même interaction entre le domaine BTB de la protéine CP190 et le domaine C-terminal marqué GST de la protéine CTCF de la drosophile sont présentés ici.
Le choix correct du test d’affinité et de solubilité, Thiorédoxine, GST ou MBP, est essentiel pour l’exécution efficace du test. Une autre étape critique est la perturbation rapide et uniforme des cellules. Il est fortement recommandé d’utiliser des sondes sonicatrices multi-pointes.
Cette méthode permet l’étude directe de la formation d’hétérodimères entre des domaines protéiques qui forment autrement des homodimères qui ne se dissocieraient pas lors de l’incubation de protéines purifiées dans le test de pulldown conventionnel.
