La culture cellulaire neuronale primaire est un système modèle idéal pour étudier la culture in vitro des neurones dissociés. L’avantage d’utiliser cette méthode est d’être en mesure de maintenir les caractéristiques cellulaires des cellules dissociées, telles que les mécanismes, les fonctions et les conditions in vitro de morphologie pendant quelques semaines aussi près que possible de l’état in vivo. Mettez les feuillets ronds de couverture dans une plaque de 24 puits sous l’armoire de biosécurité.
Ajouter 90 microlitres de poly-L-ornithine sur chaque feuillet de couverture. Fermez le bouchon et placez doucement la plaque dans l’incubateur à 37 degrés pendant deux jours. Préparez le milieu de culture et le milieu d’ensemencement et gardez-les à quatre degrés Celsius.
Préparez la solution trypsine de travail en DMEM/F12 et gardez-la à quatre degrés. Placer le milieu de culture et le milieu d’ensemencement dans l’incubateur à 37 degrés. Sortez la plaque de 24 puits de l’incubateur.
Laver le couvercle glisse trois fois avec de l’eau distillée double. Laisser sécher le couvercle pendant au moins deux heures. Préparez trois boîtes de Petri remplies de PBS froid, trois boîtes de Petri remplies de HBSS froid et cinq boîtes de Petri remplies de dissection froide moyenne sur glace.
Exciser les cornes utérine et les laver dans du PBS froid trois fois sur la glace. De là, toutes les étapes doivent être effectuées sur la glace pour minimiser les dommages aux tissus. Après la dernière étape de lavage, séparez les chiots de l’utérus dans HBSS et transférez-les au milieu de dissection froide.
Dans le milieu de dissection, décapiter les chiots avec des ciseaux. Ouvrez le calvarium du magnum foramen à la bordure inférieure de la cavité orbitale. À l’aide d’une paire de forceps fins, enlever la base du crâne et peler le crâne loin du cerveau.
Retirez soigneusement les méninges du cervelet à partir de la surface latérale du pédontcle et des pons cerebellar moyens. Coupez les deux pédulcles cerebellar et séparez le cervelet du reste du cerveau. Placez immédiatement la cerebella recueillie dans un tube conique stérile de 15 mL rempli de DMEM/F12 sur la glace.
Centrifugeuse le tube à 1000 g à quatre degrés pendant une minute en DMEM/F12. Répétez cette répéter trois fois, chaque fois en enlevant doucement le supernatant avec une pipette et en suspendant à nouveau la pastille dans le DMEM/F12 frais. Ajouter deux millilitres de trypsine préchauffée et délicatement pipette pour les mélanger.
Placez le tube dans un bain d’eau à 37 degrés pendant 12 minutes. Après l’incubation, amener le tube à l’armoire de sécurité et ajouter 10 mLs de DMEM/F12 pour inactiver la trypsine. Centrifuger le mélange à 1200 g pendant cinq minutes.
Jeter le supernatant et le résuser dans un milieu frais suivi d’une centrifugation à trois reprises. Pré-mouiller une pipette en plastique stérile avec DMEM/F2. Ajoutez 3,5 millilitres de solution de travail DNAse au même tube.
Triturer le tissu avec une pipette plusieurs fois jusqu’à ce que le fluide atteigne une couleur laiteuse homogène. Ajouter 10 mL de DMEM/F12 froid au mélange et procéder à la centrifugeuse. Centrifugeuse l’échantillon à 1200 g à quatre degrés pendant cinq minutes.
Retirer délicatement le surnatant sans déranger la pastille. Retirer le milieu d’ensemencement de l’incubateur. Ajouter 500 microlitres de milieu d’ensemencement préchauré et bien mélanger à l’aide de la pipette.
Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Diluer la suspension cellulaire avec un milieu d’ensemencement à une densité de 500 000 cellules par millilitre. Ajouter 90 microlitres du mélange à chaque puits au centre du coverslip.
Placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés pendant trois à quatre heures. Après l’incubation, ajouter 500 microlitres de milieu de culture préchauré dans chaque puits. Remplacer la plaque dans l’incubateur à 37 degrés.
Après sept jours, remplacez l’ancien milieu par le milieu de culture frais II.Préparez une plaque séparée de 24 puits avec l’organisation numérique correspondante et ajoutez 100 microlitres de PFA 4% à chaque puits. Après les journées de culture souhaitées, retirez doucement les feuillets de couverture des puits de la plaque de culture d’origine et placez-les dans les puits correspondants de la plaque PFA décrites à l’étape précédente. Ajouter pfa aux puits pour immerger complètement les glissades de couverture.
Gardez la plaque PFA à quatre degrés pendant 30 à 120 minutes. Après l’incubation, restaurer la plaque à température ambiante. Lavez le couvercle glisse doucement avec PBS pendant cinq minutes trois fois.
La figure deux du texte montre la culture cellulaire cerebellar à partir de l’E18. L’immunofluorescence de la calbinine montre les neurones purkinje avec des extensions axonales de trois jours in vitro. De sept à dix jours in vitro, les processus dendritiques sont évidents.
À 21 jours, des branches dendritiques complexes sont présentes. La figure trois du texte montre les cultures cellulaires cerebellar commençant à divers jours embryonnaires. La détection d’immunofluorescence de calbindin montre des neurones de Purkinje avec des axones tôt seulement après 18 jours in vitro.
Les cultures de neurones purkinje commencées à l’E14 et à l’E15 développeront des dendrites, mais jamais aussi complexes que celles qui se développent lorsque l’E18 est le point de départ. La figure quatre du texte montre que différents types de cellules se développent à partir des cultures E18 après 21 jours in vitro. L’immunofluorescence verte de Calbindin montre des neurones purkinje.
L’immunofluorescence rouge pour la parvalbumine dans B et C montrent des interneurones inhibiteurs. L’immunofluorescence rouge pour le canal de tension-gated de sodium dans E et F montre des neurones granuleux. Le protocole actuel est rentable et facile à mener.
À la fin de cette vidéo, vous serez en mesure de recueillir et de la culture des neurones cerebellar et de les fixer à divs désirés.
