Nous remercions le Dr Michael Wooten pour son aide dans la préparation du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIH 2RO1NS033661 (MWW).

1. Mise en place avant la récolte <ol><li> Pour générer chiots prénatales pour la récolte des neurones, planifier la reproduction entre les souris adultes 19 jours avant le jour de l&#39;isolement des neurones. (C57BL / 6 ans 2-8 mois ont été utilisés dans les accouplements pour les fins de l&#39;élaboration de ce protocole). Accouplement réussi peut être confirmé par la détection d&#39;un bouchon vaginal dans la confirmation de femmes, des palpitations ou visuelle de la grossesse. </li><li> Le jour avant l&#39;isolement des neurones: <ol class="ualpha"><li> Pour les applications immunofluorescence, des lamelles de verre manteau dans une plaque de 24 puits avec une légère couche de 3:1 collagène 1, Rat Tail: poly-D-Lysine solution. </li><li> Pour les applications de culture cellulaire, manteau tissu approprié taille en plastique culture de la céramique avec une légère couche de 3:1 collagène 1, Rat Tail: poly-D-Lysine solution. </li></ol></li><li> Reposez les plaques découvertes dans une hotte de culture tissulaire sous une lumière UV pendant la nuit. </li><li> Laver les plaques avec une solution de Hank stérile de l&#39;équilibre salin (HBSS) avantà utiliser. Plaques enduites peuvent être remplis avec du HBSS et stocké jusqu&#39;à une semaine à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li></ol> 2. Récolte des tissus <ol><li> La stérilité est toujours un facteur lors de la croissance des cultures de cellules primaires et en tant que telle, la plus grande prudence doit être exercée afin d&#39;assurer l&#39;environnement le plus stérile possible. Avec une attention particulière à une technique stérile, la dissection initiale et la récolte de tissu neural pour ce protocole peut être effectué en dehors d&#39;une hotte à flux laminaire avec un risque minimal de contamination. Après la récolte initiale, toutes les étapes ultérieures doivent être menées sous des conditions stériles maximales au sein d&#39;une hotte classé pour la culture cellulaire. </li><li> Euthanasier une souris enceinte à environ 19 jours post-fécondation par décapitation. L&#39;utilisation de l&#39;anesthésie pour euthanasier la femme enceinte n&#39;est pas recommandée car l&#39;anesthésie est connu pour causer la mort des cellules du cerveau (Stratmann, et al., 2010). En utilisant des ciseaux de dissection stériles et des pinces, de créer une ouverture dans le côté mi-ventrale de lasouris pour révéler complètement la cavité du corps. Les instruments peuvent être stérilisés à l&#39;aide d&#39;alcool et d&#39;une flamme nue. </li><li> Chiots pendant la grossesse sera situé vers la partie postérieure de la cavité du corps de la souris et doit être facilement visible dans l&#39;utérus. Avec autoclavés pinces stériles, ouvrez l&#39;utérus et de supprimer les chiots. Décapitez chiots avec des produits frais de ciseaux stériles et chef lieu retiré sur une gaze stérile sous un microscope à dissection. Les instruments stériles et peuvent être autoclavés flamme nettoyés à l&#39;aide d&#39;alcool et d&#39;une flamme nue avant et pendant l&#39;utilisation. </li><li> L&#39;aide de ciseaux stériles ou un scalpel, crâne ouvert de chiot à partir de la nuque vers le nez. Cette procédure peut normalement être achevée en insérant une extrémité des ciseaux dans le trou vertébral, puis de procéder avant. Retirez soigneusement l&#39;ensemble du cerveau avec une pince. Placez le cerveau sur de la gaze stérile. L&#39;utilisation d&#39;un scalpel stérile, retirez le cervelet et inciser en bas de la ligne médiane du cerveau afin de le séparer en deux hémisphères (Figure 1)<html> . </li><li> Saisir une petite section des méninges entourant l&#39;hippocampe avec des pinces stériles et tirez doucement. Bien qu&#39;il ne soit pas strictement nécessaire de retirer les méninges avant d&#39;isoler l&#39;hippocampe, la présence des méninges peut faire la dissection de l&#39;hippocampe plus difficile en raison de la ténacité de la membrane. Dans les deux cas, l&#39;hippocampe sera plus clairement visible après les méninges ont été supprimés. L&#39;hippocampe est une structure incurvée qui commence dans la partie distale de l&#39;hémisphère et se penche ventralement (Figure 2). Comme l&#39;intérieur, concave, côté (caudale) est confrontée à un ventricule, il est déjà libre. Par conséquent, afin d&#39;isoler l&#39;hippocampe, on a besoin de couper le long du côté externe convexe. Après la dissection, soulevez doucement chaque hippocampes avec des pinces stériles tissus et le transfert dans une boîte de culture tissulaire petit chaudes (37 ° C) HBSS sous une hotte de culture cellulaire. Le tissu cérébral peuvent être combinés de multiples petits. </li></ol>&quot;&gt; Tissu 3. Dissociation <ol><li> Avec un scalpel stérile, les tissus du cerveau en douceur hachis dans 3 ml de HBSS stériles dans un plat de 100 mm culture de tissus. </li><li> Transférer le tissu haché et HBSS à un tube de 15 ml conique. Ajouter 1,5 ml de HBSS et 0,5 ml de solution de trypsine à 0,25% pour un volume total de 5 ml. </li><li> Cap et retourner doucement le tube 4-5 fois pour mélanger. Essayer d&#39;éviter la production de bulles que l&#39;ADN libéré à partir du tissu digéré adhère aux bulles et provoquer le tissu hachées à flotter au lieu de se fixer au fond du tube (figure 3). </li><li> Incuber tissu hippocampique à 37 ° C pendant 15 minutes, retournant le tube comme ci-dessus toutes les 5 minutes. </li><li> Laisser le tissu à se déposer au fond du tube. </li><li> Soin retirer l&#39;excès de solution à l&#39;aide d&#39;une pipette stérile, laissant intact le tissu au fond du tube. </li><li> Laver les tissus culot avec 5 ml de HBSS à 37 ° C pendant 5 minutes. Répéter un total de 3 fois. Autoriser les tissus complètement réglerau fond du tube à chaque fois avant de passer à l&#39;étape de lavage suivante. </li><li> Retirez le lavage final à partir du culot de tissus et de le remplacer par 2 ml de HBSS frais. </li></ol> 4. Neuron trituration <ol><li> Avant de commencer les étapes de trituration, vous aurez besoin pour préparer polies au feu pipettes Pasteur. L&#39;utilisation d&#39;un brûleur Bunson, tenir une stérile à 9 pouces pipette Pasteur pointe (figure 4a) dans la flamme jusqu&#39;à un diamètre de l&#39;ouverture pipette est d&#39;environ 0,5 mm de diamètre et les bords de l&#39;ouverture pour pipettes ont été arrondis légèrement (figure 4b). Permettez-pipette pour refroidir complètement avant de commencer le processus de trituration. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un stérile normale 9 pouces une pipette Pasteur, doucement triturer le tissu un total de 7 fois. Morceaux de tissu sont plus grandes normale à ce stade et devraient être autorisés à se déposer au fond du tube avant de passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Transférer le surnageant dans un nouveau tube stérile de 50 ml conique. </li><li&gt; Pour le tissu restant, ajouter 2 ml de HBSS stériles et triturer un total de 5 fois en utilisant le feu poli pipette Pasteur. </li><li> Autoriser tous les morceaux restants de tissus plus à se déposer au fond du tube et de combiner avec le surnageant surnageant précédente pour un total de 4 ml dissociées des cellules neuronales. </li></ol> 5. Plaquage portable <ol><li> Compter les cellules dissociées en utilisant un hémocytomètre. </li><li> En règle générale, une fois le nombre de cellules ont été déterminés, il faut soustraire 20% de ce nombre définitif de rendre compte de toute la mort des cellules qui peuvent se produire après le placage. </li><li> Les cellules peuvent être étalées en utilisant les recommandations ci-dessous: Pour les lamelles dans une plaque à 24 puits - 6 x 10 4 cellules / puits dans 0,5 ml Pour 60 plaques mm tissus Culture - 4 x 10 5 cellules / plaque dans 3 ml Pour plaques de 100 mm de tissus Culture - 6 x 10 6 cellules / plaque dans 6 ml </li><li> Mélanger le nombre de cellules appropriées avec le volume indiqué des médias Placage Neurobasal (NeurobasalLes supports contenant B27 Supplément [1 ml / 50 ml], 0,5 mM glutamine Solution, 25 uM de glutamate (M. 147,13 g / mol), la pénicilline (10.000 unités / ml) / streptomycine (10.000 pg / ml) [250 pi / 50 ml] , 1 mM HEPES (M. 238,3 g / mol), 10% des donateurs cheval inactivé par la chaleur du sérum) et ajouter des cellules à plaques. Plaques agiter doucement pour répartir uniformément les cellules. Sérum de cheval HI-bailleurs de fonds est ajoutée à des médias de placage pour enrichir les cellules au cours des 24 premières heures de la croissance. Les cellules sont ensuite sevrés à partir du sérum et est retourné à un environnement sans sérum par la réduction de série du sérum à chaque remplacement des médias. Il convient également de noter que, bien que le glutamate à des concentrations plus élevées est toxique pour les cultures de cellules neuronales, à des concentrations inférieures ajoutées ici, il va inhiber la fixation de cellules non-neuronales 11. Cependant, il ne devrait être ajoutée aux médias de placage pour les 24 premières heures de la culture et par la suite quitté sur un support quelconque d&#39;alimentation afin de prévenir la neurotoxicité des cellules. </li><li> Pdentelles neurones dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant la nuit. </li><li> Retirez la moitié du volume des médias à partir des cellules et le remplacer par un même volume de médias d&#39;alimentation Neurobasal (médias Neurobasal contenant B27 Supplément [1 ml / 50 ml], 0,5 mM Solution glutamine, pénicilline (10.000 unités / ml) / streptomycine (10.000 mg / ml) [250 pl / 50 ml], 1 mM de HEPES (M. 238,3 g / mole). </li><li> Les neurones doivent être nourris tous les 4 jours en enlevant la moitié des anciens médias et son remplacement par le même volume de Fresh Media alimentation Neurobasal. Processus neuronaux devrait commencer à être visible lors de la Journée 1 (figure 5a) et finissent par prévaloir par jour 10 (figure 5b). </li></ol> 6. Les résultats représentatifs La capacité de croître et de la culture primaire des cellules neuronales est devenu un élément indispensable de la neuroscience. Les cultures primaires permettent au chercheur d&#39;analyser les voies cellulaires spécifiques, modification chimique et de traitement, la cible loclisation et de la croissance dans un environnement contrôlé. Bon nombre de ces procédures utilisent la méthodologie sophistiquée pour visualiser les changements spécifiques dans les réponses cellulaires. Dans ce cas, neurones de l&#39;hippocampe sont utilisées pour étudier les voies neuronales spécifiques qui se révéleraient difficile, voire impossible d&#39;analyser dans le cerveau intact. Préparation de la proximité des populations homogènes de neurones à partir de zones spécifiques du cerveau est essentielle pour l&#39;étude de la fonction cérébrale. Effets moléculaires dans les neurones individuels peuvent jouer un rôle dans la délimitation des voies d&#39;ordre supérieur tels que la mémoire ou l&#39;apprentissage. Comme ce protocole donne cultures relativement purs de neurones de l&#39;hippocampe, sans la nécessité d&#39;une couche nourricière de cellules gliales, ces neurones sont facilement utilisables pour les études d&#39;immunofluorescence. Cependant, comme avec toute la culture primaire à partir d&#39;organes contenant plusieurs types de cellules, une contamination par des cellules moins désirés peuvent se produire. Dans l&#39;isolement de cellules neuronales, la contamination par les cellules gliales peuvent être un problème commun. Les cellules gliales cêtre facilement détecté une visualisation microscopique sur la culture en tant que leur morphologie diffère sensiblement des neurones cibles (figure 6). L&#39;impact de la contamination par des cellules gliales dépendra de l&#39;utilisation prévue des cultures. Si les cellules sont utilisées pour l&#39;examen immuno-fluorescence, la contamination gliales ne peut être rien de plus qu&#39;un désagrément lorsque vous essayez de photographier des neurones individuels. Toutefois, si les cultures de neurones doivent être utilisés pour l&#39;analyse biochimique, toute contamination significative par les cellules gliales pourrait causer des changements majeurs dans les résultats. Moyens de répondre à la contamination de cellules gliales sont décrites plus loin dans la discussion. Une fois que les neurones ont été isolées et cultivées avec succès dans la culture, une application typique est d&#39;examiner les processus cellulaires immuno-fluorescence techniques. Comme l&#39;illustre la figure 7, les organites, comme la mitochondrie, peut être teinté avec des colorants vitaux ajoutés aux milieux de culture avant de fixeration. Endogènes protéines cellulaires peuvent être visualisées à partir de cellules fixes en utilisant types immuno-fluorescence des techniques (figure 8). Une fois les cellules neuronales sont fixés, des anticorps spécifiques des protéines d&#39;intérêt peuvent être introduits dans la cellule et ces protéines peuvent être visualisées en utilisant un microscope à fluorescence. Des neurones en culture a également fournir au chercheur les moyens d&#39;examiner les effets des protéines individuelles sur les fonctions neuronales. En utilisant une variété de techniques, y compris transfections d&#39;ADN, l&#39;électroporation ou de transduction virale, les protéines peuvent être surexprimé dans les cellules neuronales (figure 9). Comment neurones des cellules de répondre aux effets de la sur-exprimés protéines peut avoir des déductions directes sur la façon dont le cerveau peut répondre et vous offre la possibilité d&#39;identifier des cibles cellulaires pour des traitements médicamenteux. Les détails de ces types d&#39;expériences aller au-delà de la portée du présent document, mais ils ne montrent que les cultures préparés par cette technique sont adaptés à un large éventail de bas-sapplications tream. Toutefois, la simplicité globale de ce protocole, ainsi que, le court laps de temps nécessaire pour préparer ces cultures de neurones font une méthode idéale pour une utilisation en neurosciences aujourd&#39;hui le laboratoire. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig1.jpg" /> Figure 1. Dissection du cerveau de souris prénatale. La première incision est en bas de la ligne médiane du cerveau qui la sépare en deux hémisphères. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig2.jpg" /> Figure 2. Localisation de l&#39;hippocampe dans le cerveau de souris prénatale. Le striatum est déplacé de côté pour visualiser l&#39;hippocampe et est noté par le incurvée structure &quot;haricot&quot; de type dans la région distale de chaque hémisphère. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig3.jpg" /> Figure 3. La dissociation du tissu de l&#39;hippocampe dans une solution de trypsine. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig4.jpg" /> Figure 4. Embouts de pipette Pasteur utilisée dans la trituration de tissu hippocampique. (A) normale Pasteur pointe de pipette. (B) l&#39;incendie poli Pasteur pointe de pipette. Prenez note des bords arrondis et la diminution d&#39;environ 50% de la taille d&#39;ouverture pipette. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig5.jpg" /> Figure 5. Neurones de l&#39;hippocampe isolé en utilisant cette procédure et plaqué au Nouveau-Brunswick avec les médias. La croissance des cellules (a) un jour après placage. Processus neuronaux commencent à être visibles lors de la Journée 1. (B) La croissance des cellules 10 jours après placage, neurites sont ramifiées et se chevauchent. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig6.jpg" /> Figure 6. Neurones de l&#39;hippocampe contaminés par les cellules gliales cultivées pendant 7 jours et colorées avec l&#39;organite marqueur Mitotracker Rouge CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) et transfeDECT avec la GFP-LC3 utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). Les mitochondries sont visibles dans toutes les cellules mais seulement un seul neurone a été avec succès transfectées avec la construction fluorescent. La contamination par les cellules gliales qui rend l&#39;analyse de la GFP-LC3 expression dans les processus neuronaux difficiles à visualiser. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig7.jpg" /> Figure 7. Neurones de l&#39;hippocampe cultivées pendant 7 jours et colorées avec l&#39;organite marqueur Mitotracker Rouge CM-H 2 Xros (Invitrogen # M7513). Ce colorant vital est utilisé pour colorer les mitochondries actif dans des cellules de culture tissulaire. Les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde 4% / PBS et visualisés par microscopie à fluorescence. Le colorant lui-même est non-fluorescente jusqu&#39;à oxydé dans les mitochondries. Mitochondries actif peut être vu à travers les processus neuronaux. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig8.jpg" /> Figure 8. </strong&gt; neurones de l&#39;hippocampe cultivées pendant 7 jours, fixées avec du paraformaldéhyde 4% / PBS et immuno-colorées avec un anticorps monoclonal anti β-tubuline (Sigma # T0198). Après anticorps primaire, Oregon Green chèvre marqué-anticorps anti-souris secondaire (Invitrogen # O11033) a été ajouté et la fluorescence visualisé par microscopie. <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig9.jpg" /> Figure 9. L&#39;hippocampe des cultures de neurones ont été cultivées pendant 5 jours et transfectées avec GFP-LC3β construction d&#39;ADN en utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019). Au jour 7, les cellules ont été fixées à l&#39;aide de paraformaldéhyde à 4% / PBS et aggresomes avec LC3β GFP étiqueté incorporé dans leur membrane externe ont été visualisées en utilisant la microscopie à fluorescence. Aggresomes sont situés dans tout le corps cellulaire et neurites et sont indiqués par des flèches.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Cultures hippocampe ont été utilisés en biologie moléculaire pour plus de 20 ans. Bien qu&#39;en principe, les cultures de neurones peuvent être fabriqués à partir de n&#39;importe quelle partie du cerveau, l&#39;hippocampe cultures se sont révélées être les plus populaires en raison de l&#39;architecture relativement simple de la population de cellules nerveuses dans l&#39;hippocampe 7. Cultures d&#39;hippocampe sont généralement fabriqués à partir de tard-étape tissu embryonnaire. Ce tissu e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Vendeur </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Collagène de queue de rat 1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Poly-D-lysine Solution </td><td> Chemicon </td><td> A-003-E </td></tr><tr><td> Solution saline équilibrée de Hanks </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-095 </td></tr><tr><td> Solution de trypsine (1X) 0,25%, liquide </td><td> Invitrogen </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> Neurobasal moyen (1X) liquide </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B27 Supplément (50X) de liquide </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> L-glutamine 200 mM (100X) de liquide </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-149 </td></tr><tr><td> Pénicilline (10.000 unités / ml) / streptomycine (10.000 pg / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-148 </td></tr><tr><td> Cheval HI-sérum de donneur </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S12150H </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice

Les cultures primaires de rat et de souris neurones de l&#39;hippocampe sont largement utilisés pour révéler les mécanismes cellulaires de la neurobiologie. En isolant et en pleine croissance des neurones individuels, les chercheurs sont capables d&#39;analyser les propriétés liées à la traite cellulaire, structure cellulaire et la localisation des protéines individuelles en utilisant une variété de techniques biochimiques. Les résultats de ces expériences sont essentiels pour tester les théories portant sur les bases neurales de la mémoire et l&#39;apprentissage. Cependant, des résultats sans ambiguïté de ces formes d&#39;expériences sont fondées sur la capacité de croître des cultures de neurones à la contamination minimale par d&#39;autres types de cellules du cerveau. Dans ce protocole, nous utilisons des supports spécifiques conçus pour la croissance des neurones et une dissection minutieuse du tissu hippocampique embryonnaire pour optimiser la croissance des neurones sains tout en minimisant les types de cellules contaminantes (astrocytes par exemple). Embryonnaire de la souris tissu hippocampique peut être plus difficile d&#39;isoler que les tissus des rongeurs similaire en raison de la taille de l&#39;échantillon pour dissection. Nous montrons les techniques de dissection détaillée de l&#39;hippocampe à partir embryonnaires souriceaux jour 19 (E19). Une fois le tissu hippocampique est isolée, la dissociation des cellules neuronales douce est obtenue avec une concentration diluée de la trypsine et la rupture mécanique des cellules destiné à séparer les tissus conjonctifs tout en fournissant un minimum de dégâts à des cellules individuelles. Une description détaillée de la façon de préparer les pipettes à être utilisé dans la perturbation est inclus. Densités optimales de placage sont prévus pour l&#39;immuno-fluorescence protocoles afin de maximiser la culture de cellules avec succès. Le protocole prévoit une technique rapide (environ 2 h) et efficace pour la culture des cellules neuronales à partir de tissus de la souris hippocampe.

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Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Nous fournissons un protocole pour la culture de neurones de l&#39;hippocampe hautement purifiée à partir de cerveaux de souris prénatales sans l&#39;utilisation d&#39;une couche de cellules nourricières gliales.

L&#39;isolement et la culture de neurones de l&#39;hippocampe de souris pendant la grossesse

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

70.0K vues.  Auburn University. Nous fournissons un protocole pour la culture de neurones de l'hippocampe hautement purifiée à partir de cerveaux de souris prénatales sans l'utilisation d'une couche de cellules nourricières gliales.

Vidéo: Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Recherche

Neurosciences

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Phosphate de calcium transfection de primaire neurones de l&#39;hippocampe

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Isolement et culture de dissocié neurones sensoriels De embryons de poulet

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

L&#39;isolement et la culture des neurones de la moelle épinière chez les souris néonatales

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

Isolement et culture des neurones oculomoteurs, trochlear et moteurs rachidiens de l'islmnprénatal :GFP Souris transgéniques

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.

Isolement et culture des neurones primaires et glia de la vessie urinaire adulte de rat

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

Minimiser l’hypoxie dans les tranches hippocampales des souris adultes et vieillissantes

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

Isolement et culture des neurones ganglionnaires de Chick

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...