ثقافة الخلايا العصبية الأساسية هو نظام نموذج مثالي لدراسة الخلايا العصبية المنفصلة في الثقافة المختبرية. وميزة استخدام هذا الأسلوب هو أن تكون قادرة على الحفاظ على السمات الخلوية للخلايا المنفصلة، مثل الآليات، وظائف، ومورفولوجيا في ظروف المختبر لبضعة أسابيع في أقرب وقت ممكن إلى في حالة الجسم الحي. وضع غطاء الجولة زلات في لوحة 24 جيدا تحت مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
إضافة 90 ميكروليتر من بولي-L-ornithine على كل زلة الغطاء. أغلق الغطاء ووضع الطبق برفق في حاضنة 37 درجة لمدة يومين. إعداد الثقافة المتوسطة و البذر المتوسطة والاحتفاظ بها في أربع درجات مئوية.
إعداد حل التربسين العمل في DMEM/F12 والاحتفاظ بها عند أربع درجات. وضع الثقافة المتوسطة والمتوسطة البذر في الحاضنة في 37 درجة. أخرجي طبق الـ24 بئراً من الحاضنة
غسل الغطاء زلات ثلاث مرات مع الماء المقطر مزدوجة. اترك قسائم الغطاء لمدة ساعتين على الأقل لتجف تمامًا. إعداد ثلاثة أطباق بيتري مليئة PBS الباردة، وثلاثة أطباق بيتري مليئة HBSS الباردة، وخمسة أطباق بيتري مليئة بوسيطة تشريح الباردة على الجليد.
اُجَزّر قرون الرحم واغسلها في برنامج تلفزيوني بارد ثلاث مرات على الجليد. من هنا يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات على الجليد لتقليل تلف الأنسجة. بعد آخر خطوة غسل، فصل الجراء من الرحم في HBSS ونقلها إلى وسيط تشريح الباردة.
في تشريح المتوسطة، وقطع رأس الجراء مع مقص. فتح العجلية من ماغنوم التجويف إلى الحدود السفلية للتجويف المداري. باستخدام زوج من ملقط غرامة، وإزالة قاعدة الجمجمة وقشر الجمجمة بعيدا عن الدماغ.
إزالة بعناية السحايا من المخيخ بدءا من السطح الجانبي للرمس المخيخ الوسطى والرواد. قطع كل من الشقوق الدماغية وفصل المخيخ عن بقية الدماغ. ضع على الفور cerebella التي تم جمعها في أنبوب مخروطي معقم 15 مل مملوءة DMEM/F12 على الجليد.
جهاز طرد مركزي الأنبوب في 1،000 غرام في أربع درجات لمدة دقيقة واحدة في DMEM/F12. كرر هذا ثلاث مرات، في كل مرة إزالة بلطف مافر مع ماصة وإعادة تعليق بيليه في DMEM الطازجة/F12. أضف ميليلترين من التربسين المدفأ مسبقًا وماصة بلطف لمزجها معًا.
ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة لمدة 12 دقيقة. بعد الحضانة، وجلب أنبوب إلى مجلس الوزراء سلامة وإضافة 10 mLs من DMEM/F12 إلى تعطيل التربسين. جهاز طرد مركزي الخليط في 1، 200 غرام لمدة خمس دقائق.
تجاهل السوبر و resuspend في المتوسطة الطازجة تليها الطرد المركزي ثلاث مرات. قبل الرطب ماصة بلاستيكية معقمة مع DMEM /F2. إضافة 3.5 ملليلتر من حل العمل DNAse إلى نفس الأنبوب.
اثقب الأنسجة مع ماصة عدة مرات حتى يصل السائل إلى لون حليبي متجانس. يضاف 10 مل من DMEM/F12 الباردة إلى الخليط ثم انتقل إلى جهاز الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي العينة في 1، 200 غرام في أربع درجات لمدة خمس دقائق.
إزالة بعناية فائقة دون إزعاج بيليه. إزالة وسيطة البذر من الحاضنة. إضافة 500 ميكرولترات من البذور قبل الدفء المتوسطة ومزجها بشكل جيد باستخدام ماصة.
عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت. تخفيف تعليق الخلية مع متوسطة البذر إلى كثافة 500،000 خلية لكل ملليلتر. إضافة 90 ميكرولترات من الخليط إلى كل بئر في وسط الغطاء.
ضع اللوحة في الحاضنة على درجة 37 لمدة ثلاث إلى أربع ساعات. بعد الحضانة، إضافة 500 ميكرولترات من ثقافة مسبقة السخاء المتوسطة في كل بئر. استبدال لوحة في الحاضنة في 37 درجة.
بعد سبعة أيام، استبدال المتوسطة القديمة مع الثقافة الطازجة متوسطة II.Prepare لوحة منفصلة 24-well مع تنظيم رقمية المقابلة وإضافة 100 ميكروليتر من PFA 4٪ إلى كل بئر. بعد الأيام المطلوبة في الثقافة، وإزالة بلطف زلات الغطاء من آبار لوحة الثقافة الأصلية ووضعها في الآبار المقابلة من لوحة PFA الموصوفة في الخطوة السابقة. أضف PFA إلى الآبار لتغمر زلات الغطاء تمامًا.
حافظ على لوحة PFA عند أربع درجات لمدة 30 إلى 120 دقيقة. بعد الحضانة، واستعادة لوحة إلى درجة حرارة الغرفة. غسل الغطاء زلات بلطف مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق ثلاث مرات.
يظهر الشكل الثاني في النص ثقافة الخلية cerebellar ابتداء من E18. Immunofluorescence لcalbindin يظهر الخلايا العصبية Purkinje مع ملحقات محور عصبي من قبل ثلاثة أيام في المختبر. من سبعة إلى 10 أيام في المختبر، والعمليات التشعب واضحة.
في 21 يوما، فروع التشعب المعقدة موجودة. ويبين الشكل الثالث في النص ثقافات الخلايا المخية التي تبدأ في أيام جنينية مختلفة. الكشف المناعي من كالبيندين يظهر الخلايا العصبية Purkinje مع المحاور في وقت مبكر فقط بعد 18 يوما في المختبر.
بدأت ثقافات الخلايا العصبية بوركينجي في E14 وE15 تطوير التشعبات، ولكن أبدا معقدة مثل تلك التي تتطور عندما E18 هو نقطة البداية. ويبين الشكل الرابع في النص أن أنواع الخلايا المختلفة تتطور من الثقافات E18 بعد 21 يوما في المختبر. كالبيندين خضراء immunofluorescence يظهر الخلايا العصبية Purkinje.
المناعة الحمراء لparvalbumin في B و C تظهر interneurons المثبطة. يظهر المناعة الحمراء لـ قناة جهد الصوديوم المسور في E و F الخلايا العصبية الحبيبية. وهذا البروتوكول فعال من حيث التكلفة ويسهل سلوكه.
في نهاية هذا الفيديو، سوف تكون قادرة على جمع والخلايا العصبية cerebellar الثقافة وإصلاحها في DIVs المطلوب.
