Cette méthode peut aider à déterminer les besoins de pollinisation chez différentes espèces et à établir des relations d’incompatibilité entre les cultivars. Le principal avantage de cette approche est qu’elle permet d’évaluer plusieurs incompatibilités dans des conditions de laboratoire. Eviter les nombreux problèmes qui peuvent se produire dans les expériences effectuées dans des conditions de terrain.
Cela permet l’identification ainsi que le dévouement d’un certain nombre de cultivars aux groupes d’incompatibilité correspondants. Déterminer la relation d’intercompatibilité entre les cultivars. Cette approche peut également être utile pour déterminer l’auto-incompatibilité et la relation d’incompatibilité dans d’autres cultures fruitières comme la cerise ou la prune.
Commencez par déguster les fleurs dans le champ. Recueillir les fleurs au stade du ballon, ce qui correspond à l’étape 58 sur l’échelle BBCH pour abricot pour éviter la pollinisation précédente. En laboratoire, retirer les anthères des fleurs et les placer sur un morceau de papier pour sécher à température ambiante.
Après 24 heures, tamiser les grains de pollen avec une fine maille de 26 millimètres. Émasculer un groupe de 30 fleurs au même stade de développement de ballon pour chaque auto-pollinisation et placer les pistolets sur la mousse fleuriste dans l’eau 24 heures après l’émasculation et polliniser les pistolets à l’aide d’un pinceau avec le pollen des fleurs du même cultivar. Polliniser un autre ensemble de pistolets de chaque cultivar avec le pollen des fleurs d’un pollinisateur compatible comme un contrôle.
Après 72 heures, retirez les pistolets de la mousse de fleuriste humide et fixez les pistolets dans une solution fixative de 3:1 éthanol à l’acide acétique pendant au moins 24 heures à 4 degrés Celsius. Puis jeter le fixatif et ajouter 75% d’éthanol, en s’assurant que les échantillons sont complètement immergés dans la solution. Les échantillons peuvent être conservés dans l’éthanol à 4 degrés Celsius jusqu’à utilisation.
Dispersez les grains de pollen des mêmes cultivars utilisés pour les pollinisations de contrôle dans le milieu solidifié de germination du pollen et observez-les au microscope après 24 heures. Préparer les pistolets à la microscopie en les lavant 3 fois avec de l’eau distillée pendant une heure par lavage. Après le dernier lavage, laissez-les dans 5% de sulfite de sodium à 4 degrés Celsius pendant 24 heures.
Ensuite, autoclavez-les à un kilogramme par centimètre au carré pendant 10 minutes en sulfite de sodium pour adoucir le tissu. Placez les pistolets autoclavés sur une glissière en verre et utilisez un scalpel pour enlever les trichomes autour de l’ovaire. Puis écraser le pistolet avec une couverture.
Appliquer une goutte de bleu aniline sur les préparations pour tacher les dépôts indélétères pendant la croissance du tube pollinique et observer les tubes polliniques le long du style avec un microscope selon les instructions manuscrites. Utilisez un kit commercial pour extraire l’ADN génomique des jeunes feuilles récoltées au printemps. Ensuite, configurer PCR en combinant les reagents selon les instructions manuscrites.
Vortexing le mélange de réaction et de le distribuer parmi les puits dans la plaque PCR. Ajouter 1 microlitre de la dilution de l’ADN dans chaque puits et exécuter pcr en utilisant le programme de thermo-cyclisme décrit dans le manuscrit. Une fois la réaction terminée, analyser les résultats à l’aide d’électrophoresis capillaire ou d’électrophoresis gel agarose.
Pour l’électrophoresis capillaire ajouter 1 microlitre du produit PCR dans le puits de la plaque du lecteur avec 1 goutte d’huile minérale pour empêcher l’évaporation de l’eau. Ensuite, préparez la plaque de séparation en ajoutant un tampon de séparation. Utilisez le logiciel commercial pour l’analyseur de gènes pour créer une nouvelle plaque d’échantillon et enregistrer les noms d’échantillon pour tous les puits de la plaque.
Sélectionnez ensuite la méthode d’analyse et insérez les deux plaques dans l’analyseur génétique. Remplir le tableau capillaire d’eau distillée. Chargez le gel linéaire en polyacrylamide et cliquez sur exécuter.
Si vous analysez les résultats du PCR avec de l’électrophoresis gel, préparez un gel d’agarose de 1 % en dissolvant l’agarose dans le tampon en cours d’exécution d’électrophoresis selon les directives manuscrites. Ajouter ensuite 4 microlitres de tache d’acide nucléique au gel et mélanger délicatement. Mettre en place un plateau de gel avec un peigne et ralentir verser le gel au milieu en prenant soin d’éviter les bulles.
Laisser le gel à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit complètement solidifié, environ 30-45 minutes. Puis mettre dans la chambre d’électrophoresis. Retirez le peigne et couvrez-le d’un tampon 1x TAE.
Chargez le gel avec l’échelle d’ADN suivie des produits PCR mélangés avec du colorant de chargement. Ensuite, faire fonctionner le gel à 90 volts pendant 60-90 minutes jusqu’à ce que la ligne de teinture bleue est à environ 75% de la voie gel. Une fois la course terminée, visualisez le gel à l’aide d’un transilluminateur.
La croissance du tube pollinique dans les autopollations et les pollinisations croisées a été observée par microscopie par fluorescence afin de déterminer l’autocompatibilité pour chaque cultivar. Les cultivars ont été considérés comme auto-incompatibles lorsque la croissance du tube pollinique a été arrêtée et autocompatible lorsqu’au moins un tube pollinique a atteint la base du style. 5 combinaisons de paires d’amorce ont été employées pour identifier des s-allèles utilisant PCR en combination avec l’électrophoresis capillaire ou de gel.
Tout d’abord, les allèles S ont été identifiés par l’amplification de la première intron S-RNase à l’aide de la paire d’amorce SRc. Puis le deuxième intron de la RNase a été amplifié avec trois ensembles d’amorce pour distinguer les allèles S6, S9, S1 et S7. Et les régions variables V2 et HVB du gène SFB ont été amplifiées avec l’amorce AprFBC8 définie pour identifier les allèles Sc et S8.
Une fois que les allèles S ont été identifiés, différents groupes d’incompatibilité avec les génotypes qui sont inter-incompatibles peuvent être établis. Il est important de se rappeler d’utiliser le contrôle dans l’électrophoresis capillaire, car ils utilisent un système d’analyse automatique des fragments qui peut signaler comme plus de différences dans la taille des fragments causant une identification inexacte allèle. La combinaison d’observations par microscopie et d’analyses génétiques a donné lieu à une approche très utile pour déterminer l’auto-incompatibilité chez l’abricot et établir les relations d’incompatibilité entre les cultivars.
L’auto-incompatibilité est maintenant le lien avec les habitants de l’abricot. La détermination des facteurs semble être en cause. Les efforts futurs doivent être concentrés sur l’edification génétique de ce cultivar en abricot.
La combinaison de cette approche documentaire permet d’obtenir des renseignements précieux pour la sélection appropriée des cultivars dans les vergers commerciaux et des génotypes à motifs dans les programmes d’élevage d’abricots. Une approche similaire peut être utilisée dans d’autres cultures vivaces ligneuses.
