Este método pode ajudar a determinar os requisitos de polinização em diferentes espécies e estabelecer relações de incompatibilidade entre cultivares. A principal vantagem dessa abordagem é que permite avaliar várias incompatibilidades em condições laboratoriais. Evitando os inúmeros problemas que podem ocorrer em experimentos realizados em condições de campo.
Isso permite a identificação, juntamente com a dedicação de uma série de cultivares aos grupos de incompatibilidade correspondentes. Determinando a relação inter-compatibilidade entre cultivares. Essa abordagem também pode ser útil para determinar a autocompatibilidade e a incompatibilidade em outras culturas de árvores frutíferas, como cereja ou ameixa.
Comece por provar as flores no campo. Colete as flores na fase de balão, que corresponde ao Estágio 58 na escala BBCH para damasco para evitar a polinização anterior. No laboratório, retire os anteratos das flores e coloque-as em um pedaço de papel para secar à temperatura ambiente.
Depois de 24 horas, peneirar os grãos de pólen com uma malha fina de 26 milímetros. Emascular um grupo de 30 flores no mesmo estágio de desenvolvimento de balões para cada polinização auto e cruzada e colocar as pistolas na espuma florista na água 24 horas após a emasculação e polinizar as pistolas usando um pincel com pólen de flores da mesma cultivar. Polinizar outro conjunto de pistolas de cada cultivar com pólen de flores de um polinizador compatível como controle.
Após 72 horas, retire as pistolas da espuma florista molhada e fixe as pistolas em uma solução fixa de 3:1 etanol para ácido acético por pelo menos 24 horas a 4 graus Celsius. Em seguida, descarte o fixador e adicione 75% de etanol, certificando-se de que as amostras estão completamente submersas na solução. As amostras podem ser armazenadas no etanol a 4 graus Celsius até o uso.
Espalhe os grãos de pólen das mesmas cultivares utilizadas para as polinizações de controle em meio de germinação solidificada de pólen e observe-os sob o microscópio após 24 horas. Prepare as pistolas para microscopia lavando-as 3 vezes com água destilada durante uma hora por lavagem. Após a última lavagem, deixe-os em 5% de sulfito de sódio a 4 graus Celsius por 24 horas.
Em seguida, autoclave-os a um quilograma por centímetro quadrado por 10 minutos em sulfite de sódio para suavizar o tecido. Coloque as pistolas autoclaved sobre um slide de vidro e use um bisturi para remover as casas tricas ao redor do ovário. Em seguida, esmague a pistola com um óculos de cobertura.
Aplique uma gota de azul anilina sobre os preparativos para manchar depoimentos insensos durante o crescimento do tubo de pólen e observe os tubos de pólen ao longo do estilo com um microscópio de acordo com as instruções do manuscrito. Use um kit comercial para extrair DNA genômico de folhas jovens coletadas na primavera. Em seguida, configure o PCR combinando reagentes de acordo com as instruções do manuscrito.
Vortexing a mistura de reação e distribuindo-o entre os poços na placa PCR. Adicione 1 microliter da diluição de DNA em cada poço e execute PCR usando o programa termociclístico descrito no manuscrito. Uma vez que a reação esteja completa, analise os resultados usando eletroforese capilar ou eletroforese de gel agarose.
Para a eletroforese capilar adicione 1 microliter do produto PCR no poço da placa do leitor, juntamente com 1 gota de óleo mineral para evitar a evaporação da água. Em seguida, prepare a placa de separação adicionando tampão de separação. Use o software comercial para o analisador genético para criar uma nova placa de amostra e salvar os nomes da amostra para todos os poços na placa.
Em seguida, selecione o método de análise e insira as duas placas no analisador genético. Encha a matriz capilar com água destilada. Carregue o gel de poliacrilamida linear e clique em executar.
Se analisar os resultados do PCR com eletroforese de gel, prepare um gel de 1% de agarose dissolvendo agarose em tampão de execução eletroforese de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, adicione 4 microliters de mancha de ácido nucleico ao gel e misture suavemente. Configure uma bandeja de gel com um pente e a lentidão despeje o gel no meio, tomando cuidado para evitar bolhas.
Deixe o gel em temperatura ambiente até solidificar completamente, cerca de 30-45 minutos. Então coloque na câmara de eletroforese. Remova o pente e cubra-o com 1x de tampão TAE.
Carregue o gel com a escada de DNA seguido pelos produtos PCR misturados com corante de carga. Em seguida, execute o gel a 90 volts por 60-90 minutos até que a linha de corante azul esteja em aproximadamente 75% da pista de gel. Uma vez que a corrida esteja completa, visualize o gel usando um transilluminador.
O crescimento do tubo de pólen em polinizações auto e cruzadas foi observado por microscopia de fluorescência para determinar a compatibilidade auto(in)para cada cultivar. As cultivares foram consideradas auto-incompatíveis quando o crescimento do tubo de pólen foi preso e autocompatível quando pelo menos um tubo de pólen atingiu a base do estilo. 5 combinações de pares de primers foram usadas para identificar S-alelos usando PCR em combinação com eletroforese capilar ou gel.
Primeiro, os selados S foram identificados pela amplificação do primeiro intron S-RNase usando o par de primer SRc. Em seguida, o segundo intron da RNase foi amplificado com três conjuntos de primer para distinguir alelos S6, S9, S1 e S7. E as regiões variáveis V2 e HVB do gene SFB foram amplificadas com o primer AprFBC8 definido para identificar os alelos Sc e S8.
Uma vez identificados os S-alelos, diferentes grupos de incompatibilidade com os genótipos intercompatíveis podem ser estabelecidos. É importante lembrar de usar o controle em eletroforese capilar, uma vez que eles usam um sistema automático de análise de fragmentos que pode relatar como mais diferenças no tamanho do fragmento causando identificação de alelo imprecisa. A combinação de observações de microscopia e análise genética resultou em uma abordagem muito útil para determinar a autocompatibilidade no damasco e estabelecer as relações de incompatibilidade entre as cultivares.
A autoincompatibilidade é agora o elo com os locais em damasco. A determinação dos fatores parece estar envolvida. O esforço futuro deve ser focado na edificação genética desta cultivar em damasco.
A combinação desta abordagem documental resulta em informações valiosas para a seleção adequada de cultivares em pomares comerciais e genótipos de padrões em programas de criação de damascos. Uma abordagem semelhante pode ser usada em outras culturas perenes amadeiradas.
