Le principal avantage de notre protocole de génotypage est qu’il minimise la contamination par l’ADN maternel, qui est le principal défi lors du génotypage formalin fixe, tissus molaire paraffine intégrés. La cytométrie de flux est une méthode rapide et peu coûteuse qui facilite grandement le diagnostic des grains de beauté hydatidiformes. Pour chaque produit de conception intégré à la paraffine fixe à la formaline, ou FFPE, préparez une section de tache d’hématoxyline et d’éosine épaisse de quatre microns telle que détaillée dans cette vidéo pour évaluation morphologique par microscopie.
Placez les blocs FFPE sur la glace pendant 15 minutes pour faciliter la section. Ajustez la microtome pour couper les sections de quatre microns d’épaisseur pour l’évaluation morphologique microscopique. Placez le bloc froid dans la microtome et coupez une section de chaque bloc pour la coloration H&E.
À l’aide de forceps, transférer chaque section dans un bain d’eau de 45 degrés Celsius. Prenez la section du bain d’eau avec une glissière chargée positivement précédemment étiquetée avec le numéro d’identification de l’échantillon à l’aide d’un crayon. Placez les glissières contenant les sections dans un four à 65 degrés Celsius pour permettre aux sections d’adhérer aux toboggans.
Garder les diapositives au four pendant 25 minutes. Effectuez la coloration H&E en coulissant les glissières dans les pots de coloration appropriés pour la période de temps correcte tel que tabulé dans le protocole de texte. Monter les sections de quatre microns pour l’analyse morphologique avec le milieu de montage.
Et couvrir de glissades de couverture en verre. À l’aide des glissières H&E et d’un microscope léger, sélectionnez le bloc FFPE qui a la plus grande quantité de villosités chorioniques. Et si possible, le bloc qui a des villosités chorioniques se séparent et ne se mêlent pas aux tissus maternels.
Ajustez la microtome pour couper les sections de 10 microns d’épaisseur pour l’extraction de l’ADN. Couper 10 à 30 sections, selon la quantité de villosités chorioniques dans le bloc. Après avoir ramassé les sections avec des glissières comme avant, placez les glissières contenant les sections dans un four à 65 degrés Celsius pour permettre aux sections d’adhérer aux glissières.
Garder les diapositives au four pendant 20 minutes. Effectuez la coloration H&E en coulissant les glissières dans les pots de coloration appropriés pour la période de temps correcte tel que tabulé dans le protocole de texte. Laissez les toboggans sous le capot des vapeurs pendant au moins trois heures pour que les odeurs toxiques de xylène se dissipent.
À l’aide de forceps, arracher un petit morceau de papier d’un lingette en papier humidifié. Sous un microscope stéréo léger, utilisez les forceps et les petits morceaux de lingettes en papier humidifié à l’eau pour gratter tous les tissus maternels indésirables des sections épaisses de H&E. La clé de cette étape est la patience, en particulier pour les blocs difficiles.
Il est également important que quelqu’un d’autre examine la question pour s’assurer qu’aucun tissu maternel n’est oublié. Maintenant, arrachez un nouveau morceau de papier des lingettes de papier humidifié et utilisez-le pour recueillir les villosités chorioniques. Placer les morceaux de lingettes en papier avec leurs villosités chorioniques attachées dans un tube étiqueté de 1,5 ml.
Réduisez au minimum la quantité de lingettes de papier utilisées à cette étape, car trop peut obstruer la colonne d’extraction d’ADN et, par conséquent, réduire la quantité finale d’ADN recueilli. Suivez le protocole d’extraction d’ADN à partir d’un kit FFPE pour effectuer l’extraction de l’ADN. À l’aide d’un spectrophotomètre de laboratoire, chargez 1 microlitre d’ADN et mesurez l’absorption à 216 nm pour la quantification.
Chargez 1 microlitre d’ADN sur un gel d’agarose de 2% et exécutez l’électrophoresis de gel à une tension de 80 à 100 volts pour l’évaluation qualitative. Sur la base des résultats de l’évaluation de l’ADN, choisissez le volume d’ADN à utiliser dans l’amplification multiplexe courte répétition PCR en tandem. Visez à utiliser un minimum de 1000 nanogrammes d’ADN.
Procédez à l’amplification de PCR, à l’électrophoresis capillaire, et à l’analyse de données telle que décrite dans le protocole de texte. Pour choisir le bloc FFPE idéal, utilisez des diapositives H&E sur un microscope léger pour sélectionner un bloc FFPE qui a environ 50 à 70% de ses tissus composés de villosités chorioniques. Pour les blocs qui n’ont pas la quantité idéale de villosités chorioniques, enrichir pour les villosités chorioniques que la section est effectuée.
Pour ce faire, identifiez quel côté des sections fraîchement coupées contient des villosités plus chorioniques selon sa diapositive H&E correspondante. Ensuite, utilisez une lame pour couper l’autre moitié qui doit être jetée afin d’enrichir pour les villosités chorioniques. Pour effectuer la section du meilleur bloc FFPE possible, coupez quatre sections de 50 microns d’épaisseur à l’aide d’une microtome.
Dans le cas où un bloc de FFPE idéal n’est pas disponible, visez à maintenir le rapport des villosités chorioniques au tissu maternel néanmoins. Par exemple, si seulement 30% du bloc est composé de villosités chorioniques, tandis que le reste a des tissus maternels, puis enlever au moins la moitié de la section qui contient les tissus maternels, et utiliser plus de sections pour compenser. Placer les sections dans des tubes de 15 mL étiquetés.
Pour la déparaffinisation et la réhydratation, travailler dans un capot de fumée pour ajouter chaque réaccente et attendre la période de temps appropriée telle que compilée dans le protocole de texte. Ensuite, retirez le réaccente par aspiration sous vide à l’avec une pipette Pasteur. Ensuite, ajoutez une solution de citrate de quatre degrés Celsius aux tubes de 15 mL.
Après avoir placé dans un bain d’eau de 80 degrés Celsius pendant deux heures, laissez la solution refroidir à la température ambiante. Retirez la solution de citrate par aspiration sous vide. Ajouter six millilitres de 1x PBS, vortex, et attendre une à deux minutes pour permettre aux tissus de se déposer au fond.
Si nécessaire, centrifuger les échantillons à 1000 RPM pendant 30 secondes. Retirez le 1X PBS par aspiration sous vide. Maintenant, ajoutez un mL de solution de pepsine préchauffée et placez-le dans un bain sec de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Vortex toutes les 10 minutes. Préparer la solution propidium iodure ribonuclease A dans les 10 dernières minutes de cette incubation. Ajouter un autre six mL de 1x PBS, vortex, et attendre une à deux minutes pour permettre aux tissus de se déposer au fond.
Encore une fois, retirez le 1x PBS par aspiration sous vide. Ajouter 550 microlitres de la solution propidium iodée ribonuclease A, et placer les échantillons dans un bain sec de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Utilisez des forceps pour placer un morceau de cinq cm sur cinq cm de maille de filtration de 48 microns dans la partie supérieure des tubes de fond ronds en polystyrène pour une utilisation avec le cytomètre d’écoulement.
Filtrer la solution en pipetant le liquide à travers le maillage et dans le tube. Les échantillons sont maintenant prêts à être exécutés sur le cytomètre d’écoulement. Gardez-les enveloppés dans du papier d’aluminium jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être exécutés.
Enfin, effectuez la cytométrie du débit et l’analyse des données décrites dans le protocole texte. Le génotypage microsatellite d’une taupe hydatidiforme partielle, avec l’ADN du patient et de son partenaire, révèle que la taupe du patient est dissimique triploïde. Le premier marqueur montre deux pics dans le produit de la conception.
Le premier pic provient de la mère, puisque seule la mère a un pic de cette taille. Suivant le même raisonnement, le deuxième pic provient du père puisqu’il partage le même allèle. Remarquez comment le deuxième pic est beaucoup plus élevé que le premier, indiquant qu’il y a probablement deux doses du même allèle paternel dans ce pic.
La contamination maternelle est très minime dans ce produit de la conception parce qu’elle affiche un pic très minuscule à la position du deuxième allèle maternel. Le deuxième marqueur montre trois pics dans le produit de la conception. Deux de ces pics proviennent du père, et un de la mère.
Les troisième et quatrième marqueurs sont similaires au premier marqueur, et montrent également deux allèles provenant du père, et un de la mère. Puisque chacun des quatre marqueurs montrent uniformément trois allèles, deux provenant du père et un de la mère, on peut conclure que ce produit de conception est triploïde dispermic et confirme le diagnostic de taupe partielle. Pour l’interprétation des résultats du génotypage, il est important d’être conscient du niveau de contamination basé sur les notes prises pendant les étapes de nettoyage.
Dans certains cas, nous ne sommes pas en mesure de parvenir à une conclusion en suivant ces deux méthodes. Dans de tels cas, nous utilisons d’autres méthodes telles que FISH, pour découvrir les vrais génotypes. Le génotypage microsatellite a permis un diagnostic molaire précis et a ouvert la voie à une meilleure compréhension des génotypes associés aux diverses caractéristiques des grains de beauté hydatidiformes.
