Ce protocole fournit une méthodologie normalisée pour la préparation et la manipulation des tissus musculaires dans les milieux précliniques et les essais cliniques, ce qui est important pour obtenir des résultats fiables dans le domaine de la DMD. Les techniques sont pertinentes pour les essais de saut d’exon pour DMD. Et le principal avantage est que, ils sont bien établis et reproductibles s’ils sont réalisés collectivement.
Ces techniques sont principalement axées sur le saut d’exon dans DMD, mais avec un changement d’amorce, les mêmes techniques peuvent être appliquées à d’autres maladies traitées avec des thérapies d’épissage. Ces méthodes peuvent être utilisées pour atteindre l’efficacité de saut d’exon à la fois et l’ARN et les protéines. Pour préparer un échantillon aux fins d’analyse, mélangez d’abord des volumes égaux de gomme de tragacanth et d’eau jusqu’à ce que la gomme devienne molle et collante.
Chargez ce mélange en seringues de 25 millilitres et distribuez de 0,5 à un centimètre de gomme sur des disques de liège individuels. Étiquetez les disques de l’autre côté et placez un contenant d’isopentane dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’une partie du liquide gèle. Placez chaque spécimen dans la gomme de tragacanth sur les disques avec un axe longitudinal de chaque muscle perpendiculaire au liège.
Placez la gomme au fond de chaque muscle pour aider à maintenir le muscle en place, et utilisez des pinces à épiler pour congeler les spécimens dans l’isopentane froid. Déplacez les spécimens en continu pendant une minute ou jusqu’à ce qu’ils soient complètement congelés avant de les placer temporairement sur de la glace sèche. Ensuite, placez les spécimens dans des flacons de verre pour un stockage de 80 degrés Celsius.
Pour sectioner le tissu musculaire gelé pour analyse, réglez un cryostat à une température de travail de 25 degrés Celsius, et pour monter le bloc musculaire sur le support. Couper le bloc tissulaire jusqu’à ce que les sections plates soient atteintes. Pour l’analyse inverse de transcriptase PCR et de tache occidentale, obtenez 10 tranches épaisses de micromètre.
Pour l’analyse immunohistochimique, obtenir six à huit tranches micromètres d’épaisseur, et pour l’hématoxyline et la coloration de l’éosine, obtenir 10 à 12 tranches d’épaisseur micromètre. Après leur acquisition, placer les sections tranchées dans deux tubes millilitres. Stockez les échantillons pour le PCR et le ballonnement occidental à 80 degrés Celsius.
Ici, le système d’électrophoresis de micropuce, les images de gel des réactions inverses de PCR de transcriptase, et les résultats de séquençage de la bande sautée de deux patients avant et après traitement avec un oligonucleotide antisens dans un essai de phase d’escalade de dose un sont montrés. Les deux patients hébergent des suppressions. Comme prévu, avant le traitement, les deux patients n’ont montré aucun saut et seulement une bande non sautée pourrait être visualisée.
Après 12 semaines de traitement, une bande inférieure sautée claire a été visualisée pour le deuxième patient, cependant, il était toujours difficile de détecter n’importe quel produit sauté pour le premier patient. Les résultats de séquençage ont montré une concatenation des exons 47 et 54 pour le deuxième patient, et des exons, 44 et 54 pour le premier patient. Pour calculer le pourcentage sauté, la concentration molaire de la bande sautée a été divisée par les bandes sautées et non sirotées.
Comme prévu, aucune bande de dystrophine n’a été détectée par la tache occidentale avant traitement. Après traitement, une bande a été détectée du deuxième patient avec un poids moléculaire inférieur comparé à celui observé dans le contrôle sain. Le premier patient, cependant, n’a montré aucun niveau détectable de dystrophine après traitement.
Il est essentiel de manipuler correctement le tissu musculaire et de placer chaque spécimen sur la gencive tragacanth de manière cohérente. Les sections tissulaires peuvent être analysées de différentes façons, y compris artificielle à PCR, PCR numérique, tache occidentale, immunohistochimie, et avec différents types d’omiques. Ces techniques peuvent être accélérer, le développement, exon supplémentaires sauter des médicaments ciblant différents exons, et peut être appliquée au développement de base virale et à nouveau dans l’édition pour DMD.
