Bonjour à tous. Je m’appelle Nicolas Wein. Je suis chercheur principal au Nationwide Children’s Hospital de Columbus, ohio.
Et aujourd’hui, nous allons vous montrer une vidéo sur la façon de prendre une biopsie de la peau et de la convertir en myoblastes et myotube. C’est un outil très utile pour étudier le désordre neuromusculaire. En outre, c’est une technologie beaucoup plus rapide par rapport à IPSC parce que nous utilisons deux types différents de virus pour lutter directement contre ce type de cellule.
Cette vidéo démontre le protocole pour établir des cultures fibroblastes dérivées de la peau humaine, la conversion en myoblastes, puis des myotubes différenciés. Une biopsie de peau est transférée à la culture cellulaire pour dériver des fibroblastes cutanés. Les lentivirus porteurs de gènes hTERT et MYOD sont utilisés pour transduire ces fibroblastes.
Sur l’addition du milieu de croissance de myoblaste complété avec la doxycycline, le gène de MYOD est exprimé, induisant la conversion des fibroblastes dans les myoblastes. Ensuite, le milieu est commuté à un milieu de différenciation, également complété par la doxycycline. Puis les myoblastes fusionnent les uns avec les autres, formant des myotubes multinucléés.
Aspirez le média du tube et rincez la biopsie avec 10 millilitres, un x PBS à température ambiante, trois fois. Après le troisième lavage, laisser le PBS dans le tube. Verser le PBS et la biopsie de la peau sur un plat carré de 10 centimètres.
À l’aide de scalpels stériles, couper la biopsie en morceaux aussi petits que possible. À l’aide d’une pipette, transférer un morceau de peau individuel sur un plat stérile de 10 centimètres carrés. Aspirer l’excès de PBS autour de chaque pièce.
Veillez à ne pas aspirer la pièce elle-même. Couvrir partiellement la vaisselle avec le couvercle et laisser sécher les morceaux de biopsie de la peau pendant cinq à 20 minutes. Ne laissez pas sécher les morceaux trop longtemps.
Une fois les morceaux secs, inclinez le plat à un angle de 45 degrés et ajoutez lentement 12 millilitres de milieu fibreux au coin du plat. Abaissez le plat, en distribuant soigneusement les supports afin que les pièces ne soient pas soulevées par les médias. Placer les plats dans l’incubateur.
Remplacez les médias en cinq à sept jours, et une fois par semaine par la suite. Graines fibroblastes primaires à 30% de la confluence et deux puits d’une plaque de puits 12, environ 20.000 cellules par puits, afin d’avoir environ 50% de la confluence le lendemain. Pour la transduction lentiviral, ajouter deux à 5 milliards de génomes viraux de hTERP Puromycin Lentivirus et 400 microlitres de milieu fibroblaste.
Ajouter le mélange de lentivirus à un puits. Au deuxième puits, ajouter seulement 400 microlitres de milieu fibroblaste. Le lendemain, ajouter un millilitre de médias.
Un ou deux jours plus tard, transférer les cellules dans une plaque de six puits et les cultiver jusqu’à atteindre 60 à 70% de confluence. Compléter le milieu fibroblaste avec un microgramme par millilitre de puromycine et ajouter deux millilitres à chaque puits. Gardez les cellules sous sélection jusqu’à ce que toutes les cellules du puits de contrôle soient mortes pendant au moins 12 jours, changeant les médias tous les deux à trois jours.
Graphique de graine H exprimant des fibroblastes à 30% confluent dans trois puits de la plaque de puits 12 pour avoir environ 50% de confluence le lendemain. Pour la transduction lentivirale, mélanger deux à cinq milliards de génomes viraux du lentivirus MYOD Hygromycin B et 400 microlitres de milieu fibroblaste et ajouter à deux puits. Ajouter un millilitre de milieu le lendemain.
Un ou deux jours plus tard transférer les cellules dans une plaque de six puits et se développer jusqu’à 60 à 70% confluent. Compléter les supports de croissance avec 400 microgrammes par millilitre d’Hygromycine B.Ajouter deux millilitres à chaque puits. Gardez les cellules sous sélection jusqu’à ce que toutes les cellules des puits de contrôle soient mortes, prenant généralement au moins 12 jours, changeant les médias tous les deux à trois jours.
Pour l’induction des myoblastes, cultiver des fibroblastes jusqu’à ce qu’ils soient 70% confluents. Ajouter huit microgrammes par millilitre de Doxycycline au milieu de croissance du myoblaste. Toujours utiliser des aliquots frais de Doxycycline et moyen.
Le support doit être préparé juste avant tout changement médiatique. En outre, la Doxycycline ne doit pas être recongelée. Aspirer le milieu fibroblaste et rincer les cellules avec PBS.
Ajouter 10 millilitres de médias myoblastes complétés. Deux à trois jours plus tard, les cellules sont confluentes à 90 à 95 % et leur morphologie aura changé. Aspirer le média de croissance du myoblaste et rincer la surface cellulaire avec PBS.
Ajouter 10 millilitres de média de différenciation qui a été complété par huit microgrammes par millilitre de Doxycycline fraîche. Continuez à changer les médias tous les deux ou trois jours jusqu’à ce que des myotubes soient formés. Sept à dix jours après l’initiation de la différenciation myotube, les cellules doivent être entièrement différenciées, mais cela varie d’une lignée cellulaire à l’autre.
Les premiers fibroblastes peuvent émerger cinq jours après que les morceaux de peau ont été en culture. Dans l’image B, les fibroblastes sont confluents et prêts à être transférés dans des flacons carrés de 75 centimètres pour une prolifération ultérieure. Il est important de congeler plusieurs flacons de fibroblastes à faible nombre de passage que les cellules primaires entrent dans la sénescence réplicative.
Une fois que les lignées cellulaires FM sont établies pour la conversion des fibroblastes en myotubes, les fibroblastes doivent proliférer jusqu’à 70% confluent comme le montre l’image A.Il est important de ne pas dépasser 80% de confluence, car une densité élevée peut nuire à la différenciation. Après l’ajout de Doxycycline au milieu, dans les deux à quatre jours les cellules deviennent myoblastes, caractérisées par une morphologie allongée et une orientation parallèle comme on le voit dans l’image B.Les myotubes différenciés sont montrés dans l’image C.Le temps de fusion et de différenciation des myotubes peut varier de sept à 21 jours selon le génotype cellulaire. Les cellules doivent être collectées ou fixées avant de se détacher.
Le début du détachement peut être observé par la couleur et la luminosité des bords du myotube, comme le soulignent les flèches de cette image. Par immunofluorescence, l’expression de protéines musculaires matures spécifiques confirme la conversion réussie des fibroblastes en myotubes. Dans ces images, trois cellules différentes sont montrées.
Le degré de différenciation varie d’une cellule à l’autre, et peut ou non être réalisé par la mutation primaire car c’est le cas des cellules dans les figures B et C.Une validation supplémentaire du modèle a été confirmée par RNAseq. Comme le montre cette intrigue, il y a plus de 12 000 gènes exprimés différemment détectés dans les myotubes FM par rapport à celui du muscle squelettique. La corrélation significative entre les deux transcriptomes soutient que les cellules FM ont un profil d’expression spécifique au muscle démontrant qu’ils sont un substitut utile et fiable pour les lignées cellulaires dérivées des muscles.
Pour illustrer l’utilité de ce modèle in vitro, nous avons utilisé l’une des duplications exoniques les plus courantes dans le gène DMD. La duplication d’Exon deux conduit à la perturbation du cadre de lecture DMD, et son saut peut soit conduire à la restauration de ce cadre de lecture ou l’utilisation du site d’entrée interne ribosome. Cette thérapie a déjà été validée avec des études in vivo Figure A, nous avons démontré la preuve de concept par l’analyse RTPCR de cette lignée cellulaire mutée particulière, avec et sans traitement par saut d’exon.
La tache occidentale dans la figure B démontre que la protéine fonctionnelle de dystrophine est exprimée dans les cellules traitées. En comparant l’efficacité de cette thérapie aux modèles in vivo, les résultats soutiennent la fiabilité de la technique de différenciation cellulaire et soutiennent son utilisation pour tester diverses thérapies géniques spécifiques à la mutation. Avant les études cliniques nécessaires pour tester l’efficacité du soutien thérapeutique officiel sur les troubles neuromusculaires, en fonction de la capacité des modèles animaux et cellulaires.
Le développement de modèles animaux, bien qu’il soit plus facile de nos jours, n’est pas une option réalisable pour chaque mutation spécifique. La génération de myoblastes à travers des cellules IPS dérivées de fibroblastes cutatiques est une alternative, mais c’est une technique qui prend beaucoup de temps. Ainsi, cette procédure est une alternative simple à la génération IPS qui permet la conversion directe des fibroblastes en myoblastes.
Il facilite l’accès aux modèles cellulaires humains en évitant l’application plus invasive de biopsies musculaires En conclusion, cette conversion directe des fibroblastes en myoblastes est un outil puissant pour tester les thérapies pour les troubles neuromusculaires dans un contexte spécifique de limitation.
