La caractérisation des protéines liant à l’ARN in vivo reste un défi majeur en raison de la nature complexe de l’ARN et des nombreux facteurs affectant son interaction avec les protéines. La protéine liant l’ARN ou l’affinité RBP-ARN est mesurée à l’intérieur des cellules bactériennes vivantes. Puisque l’environnement cellulaire affecte à la fois la structure de l’ARN et la liaison RBP-ARN qui en résulte, la mesure de l’affinité in vivo est cruciale pour comprendre de telles interactions dans les systèmes naturels.
Le secret du succès réside dans la conception des plasmides. La conception devrait utiliser plusieurs vagues de delta et éviter l’insertion de codons stop et mutations frameshift. Commencez ce protocole en concevant la cassette du site de liaison.
Chaque mini gène contient un site de restriction EagI, 40 bases de l’extrémité principale du gène de résistance à la kanamycine, le promoteur pLac/Ara, le site de liaison ribosome, l’AUG du gène mCherry, un espaceur, un site de liaison RBP, 80 bases de l’extrémité principale du gène mCherry, et un site de restriction ApaLI. Pour augmenter le taux de réussite de l’analyse, concevoir trois cassettes de site de liaison pour chaque site de liaison avec des espaceurs composés d’au moins une, deux et trois bases. Double digeste à la fois les mini gènes et le vecteur cible avec EagI HF et ApaLI avant d’effectuer la purification des colonnes des digestes.
Ligate les mini gènes digérés à l’épine dorsale du site de liaison contenant le reste du gène mCherry reporter, terminator et un gène de résistance à la kanamycine. Transformez ensuite la solution de ligature en 10 cellules top 10 d’Escherichia coli. Après avoir identifié des transformateurs positifs par séquençage Sanger, stockez les plasmides purifiés dans le format 96 puits à moins 20 degrés Celsius.
Stockez également les souches bactériennes sous forme de stocks de glycérol dans le format 96 puits à moins 80 degrés Celsius. Commandez sur mesure la séquence RBP requise sans codon d’arrêt comme mini gène ADN à double brin avec des sites de restriction aux extrémités. Transformez les plasmides préparés en cellules bactériennes chimiquement compétentes contenant déjà un plasmide mCerulean RBP.
Pour gagner du temps, plaquez les cellules à l’aide d’un pipetter à huit canaux sur huit plaques de voie contenant de l’agar Luria-Bertani avec des antibiotiques pertinents. Les colonies devraient apparaître en 16 heures à 37 degrés Celsius. Choisissez une colonie unique pour chaque double transformateur et transférez-la dans 48 plaques de puits contenant 1,5 millilitres de LB avec des antibiotiques appropriés.
Faire croître les cellules sur une période de 18 heures à 37 degrés Celsius secouant à 250 RPM. Conservez les nuitées sous forme de stocks de glycérol à moins 80 degrés Celsius dans 96 plaques de puits. Le matin, programmez le robot pour réchauffer 180 microlitres de milieu semi-poreux ou de SPM dans 96 plaques de puits.
Programmez le robot pour préparer la plaque d’incitation. Dans une assiette propre de 96 puits, préparer des puits avec SPM composé de 95%BA et 5%LB. Le nombre de puits correspond au nombre souhaité de concentrations d’inducteurs.
Ajouter le C4-HSL aux puits de la plaque inducteur qui contiendra la plus forte concentration d’inducteurs. Ensuite, programmez le robot pour diluer en série le milieu de chacun des puits de concentration les plus élevés en 23 concentrations inférieures allant de zéro à 218 nanomolaires. Le volume de chaque dilution inducteur devrait être suffisant pour toutes les souches.
Pour diluer les souches du jour au lendemain, programmez le robot pour le diluer par un facteur de 10 en mélangeant 20 microlitres de bactéries avec 180 microlitres de SPM dans 48 plaques de puits. Puis diluer à nouveau par un facteur de 10 en prenant 20 microlitres de la solution diluée dans la plaque de contrainte pré-préparée adaptée à la mesure fluorescente. Maintenant, programmez le robot pour ajouter l’inducteur dilué de la plaque inducteur aux 96 plaques de puits avec les souches diluées en fonction des concentrations finales.
Secouez les 96 plaques de puits à 37 degrés Celsius pendant six heures. Pendant ce temps, prendre des mesures de la densité optique ou od à 595 nanomètres ainsi que mCherry et fluorescence mCerulean via un lecteur de plaque toutes les 30 minutes. À des fins de normalisation, mesurer la croissance du SPM sans ajout de cellules.
Voici des parcelles tridimensionnelles pour une souche positive. Les parcelles représentent les niveaux bruts d’OD, la fluorescence mCerulean, et la fluorescence de mCherry en fonction du temps et de la concentration d’inducteur. mCerulean niveaux d’expression à état stable ont été calculés pour chaque concentration d’inducteur pour les souches positives et négatives.
Le taux de production de mCherry a également été calculé pour chaque concentration d’inducteur pour les souches positives et négatives. le taux de production de mCherry a été tracé en fonction de la fluorescence moyenne mCerulean moyenne sur deux doublons biologiques pour deux souches. L’ajustement KRBP en utilisant la formule de montage est montré pour la souche positive présentant une réponse de liaison spécifique.
Pour la souche négative, aucune valeur KRBP n’a été extraite. Des courbes normalisées de réponse de dose ont été déterminées pour 30 souches différentes basées sur deux RBPs comme 10 emplacements contraignants à différents endroits. Trois types de réponses sont observés, une affinité élevée, une faible affinité et aucune affinité.
Voici les résultats quantitatifs krbp pour deux RBPs, protéine de manteau MS2 et protéine de manteau de PP7 avec 10 cassettes différentes de site de liaison. Des courbes de réponse de dose pour la protéine de manteau de MS2 avec un emplacement mutant de liaison à quatre endroits différents sont montrées ici pour démontrer l’effet de l’espacement mutant sur la production de mCherry. La séquence du site de liaison muté testé est affichée.
Il est important d’utiliser une technique structurelle telle que la forme chercher à sonder chimiquement la structure du complexe protéine-ARN et à visualiser quelles régions d’ARNm sont affectées par la liaison ARN. Récemment, nous avons utilisé cette technique d’une manière à haut débit pour mesurer simultanément l’affinité des RBP avec 10 000 sites contraignants.
