L’immunoprécipitation de l’ARN en tandem suivie du séquençage, ou RIPiT-Seq, est une méthode pour identifier quelles régions de l’ARN sont liées par une paire particulière de protéines liant l’ARN. L’avantage le plus unique de RIPiT est sa capacité à cibler deux protéines différentes en deux purifications. Cela fournit un moyen puissant d’enrichir pour un complexe de protéines ARN distincte sur le plan de la composition d’autres complexes.
En outre, RIPiT-Seq est indépendant de croisement UV, et peut être appliqué à beaucoup de protéines qui agissent sur l’ARN sans le lier directement. Bien que cette méthode ne s’étende pas directement vers la thérapie ou le diagnostic, les protéines liant l’ARN et le traitement de l’ARN ont été associés à plusieurs maladies comme les neuropathies et le cancer. RIPiT-Seq fournit un outil pour étudier les fonctions des protéines liant l’ARN liées à la maladie.
RIPiT-Seq nécessite un système où une protéine marquée par l’épitope peut être exprimée. Il n’a été testé que dans les cellules HEK293, et est le plus agréable à la culture cellulaire. Cependant, maintenant avec notre capacité à étiqueter les protéines à l’aide de CRISPR, RIPiT-Seq peut être applicable à divers systèmes modernes.
Le succès du RIPiT dépend de deux immunoprécipices efficaces, il sera donc essentiel d’optimiser les conditions d’immunoprécipice pour l’anticorps utilisé. En outre, travailler avec l’ARN exige des précautions appropriées, de sorte que les reagents sans RNase devraient être utilisés pendant et après l’extraction de l’ARN. Lauren Woodward, étudiante diplômée dans mon laboratoire, démontrera la procédure.
Commencez par laver délicatement les cellules monocouches avec 15 millilitres de PBS réfrigéré par plaque de 15 centimètres. Puis racler les cellules en 30 millilitres de PBS et les recueillir dans un tube conique de 50 millilitres. Pelleter les cellules en centrifugant à 400 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius, et jeter le supernatant.
Ajouter quatre millilitres de tampon de lyse hypotonique glacée et utiliser une pipette P1000 pour suspendre à nouveau les cellules. Transférer le lysate dans un tube de cinq millilitres et incuber sur la glace pendant 10 minutes. Placez le lysate dans un bain de glace et sonicate selon les instructions manuscrites.
Ajouter ensuite 108 microlitres de cinq molaires de chlorure de sodium pour ajuster la concentration de sel à 150 milli molaires. Ensuite, centrifugez le lysate à 12 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, et recueillez 20 microlitres du supernatant pour l’analyse des taches occidentales. Pré-laver les perles d’agarose FLAG selon les instructions manuscrites et appliquer le surnatant restant à 750 microlitres de perles dans un tube de cinq millilitres.
Incuber les perles d’agarose FLAG avec l’extrait cellulaire pendant une à trois heures à quatre degrés Celsius avec un mélange doux. Après l’incubation, pelleter les perles par centrifugation à 400 g pendant une minute à quatre degrés Celsius, et recueillir 20 microlitres du supernatant pour l’analyse des taches occidentales. Jetez le supernatant restant et lavez les perles en les résusant en quatre millilitres de tampon de lavage iso.
Pelleter les perles à nouveau et enlever le supernatant. Diluer RNase I en 750 microlitres de tampon de lavage iso selon les instructions manuscrites, et l’ajouter aux perles d’agarose FLAG. Incuber le mélange à quatre degrés Celsius avec un mélange doux, puis pelleter les perles par centrifugation.
Recueillir 20 microlitres de supernatant pour l’analyse des taches occidentales, et jeter le reste. Ensuite, lavez les perles avec le tampon de lavage d’iso comme décrit précédemment. Ensuite, effectuez l’élitution d’affinité en ajoutant 375 microlitres de tampon d’élitution aux perles, et en secouant doucement le mélange à quatre degrés Celsius pendant une à deux heures.
Après l’incubation, pelleter les perles et recueillir un aliquot de 15 microlitres de l’élitution pour l’analyse des taches occidentales. Tandis que l’elution d’affinité est en cours, exécutez la conjugaison magnétique d’anticorps de perle. Commencez par laver 50 microlitres de perles magnétiques en un millilitre de tampon de lavage iso.
Resuspendez les perles dans 100 microlitres de tampon de conjugaison et ajoutez la quantité appropriée d’anticorps. Ensuite, incuber les perles pendant au moins 10 minutes à température ambiante. Lavez les perles magnétiques deux fois avec le tampon de conjugaison et réutilisez les perles dans 375 microlitres de tampon de dilution RIPiT.
Conserver les perles sur la glace jusqu’à l’immunoprécipice. Appliquer l’élitution d’affinité FLAG sur les perles magnétiques couplées aux anticorps et incuber avec un mélange doux pendant une à deux heures à quatre degrés Celsius. Capturez les perles magnétiques à l’aide d’un aimant et recueillez 15 microlitres de supernatant pour l’analyse des taches occidentales.
Ensuite, lavez les perles sept fois avec le tampon de lavage d’iso. Procéder à l’allongement de l’allongement en réutilisant les perles magnétiques dans 100 microlitres de tampon d’échantillon clair et en incubant la suspension sur la glace pendant 10 minutes. Pendant l’incubation, feuilletez périodiquement les perles pour les résuser.
Capturez les perles magnétiques sur un aimant et recueillez 15 microlitres d’élitution pour l’analyse des taches occidentales. Transférer l’élitution restante dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Pour extraire l’ARN, ajouter 320 microlitres d’eau sans RNase et 400 microlitres d’alcool d’isoamyle phénol-chloroforme à l’élitution du RIPiT.
Vortex le mélange, puis le centrifuger à 12 000 g pendant cinq minutes. Recueillir 350 microlitres de la phase aqueuse dans un tube séparé. Ajouter l’acétate de sodium, le chlorure de magnésium, le glycogène et l’éthanol à l’échantillon prélevé et incuber le mélange pendant la nuit à 20 degrés Celsius négatifs.
Le lendemain, pelleter l’ARN par centrifugation à 12 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et le laver à 70% d’éthanol. Après le lavage à l’éthanol, traiter l’ARN avec la kinase polynucléotide T4, ou PNK, sans ATP, et effectuer la purification phénol-chloroforme selon les instructions manuscrites. Resuspendez l’ARN propre dans 4,5 microlitres d’eau sans RNase.
Pour quantifier le rendement de l’ARN, radiolabel l’ARN avec PNK et 32P étiquetés ATP selon les instructions manuscrites. Utilisez une échelle d’ADN de faible portée et un oligo synthétique nucléotide de 20 à 40 pour les normes de taille et de quantité. Résoudre l’ARN étiqueté sur un gel 26%urée-polyacrylamide.
Séchez le gel selon les instructions manuscrites et exposez le gel à un écran de phospho jusqu’à ce qu’un signal adéquat soit détecté. Cette technique a été utilisée pour étudier les interactions du complexe de jonction d’exon ou EJC. L’analyse occidentale des taches de protéines purifiées à chaque étape majeure de la procédure RIPiT montre que l’EJC purifié contient à la fois eIF4A3 et MAGOH.
Le contrôle négatif, HNRNPA1, n’est pas détecté dans l’élitution. La force du signal d’empreinte arn est corrélée avec la quantité d’interaction entre les protéines ARN. Une empreinte plus forte est observée lorsque ripit a été effectuée sur les cellules traitées avec de la puromycine, ce qui augmente l’occupation de l’EJC sur l’ARN.
Pour s’assurer que le RIPiT a été efficace, il est important de tester l’efficacité de la propriété intellectuelle par tache occidentale. Il est également important d’évaluer la quantité et la qualité de l’ARN avant de procéder à un séquençage profond. En 2018, le laboratoire Singh a utilisé avec succès cette technique pour purifier deux variations distinctes sur le plan de la composition du complexe de jonction d’exon et identifier les modèles de liaison arn.
Si les chercheurs choisissent de détecter les empreintes de l’ARN par autoradiographie, toutes les procédures et protocoles appropriés de radioprotecteur devraient être suivis.
