Ce protocole décrit la nouvelle technique d’enrichissement simultané de plusieurs MNP avec des anticorps suivie d’une analyse de spectrométrie de masse d’acquisition indépendante des données pour obtenir un aperçu biologique de la localisation du site et des discussions croisées. Il s’agit d’une technique efficace et rapide qui permet l’identification et la quantification simultanées des peptides avec tranchage contenant des MNP d’acétylation et de succinylation avec seulement de petites quantités d’entrée d’échantillon. Le suivi des modifications post-translationnelles est une étape importante dans la caractérisation et la lutte contre les différents états de la maladie.
Nous sommes déjà conscients que certains cancers et le diabète sont fortement réglementés par ces modifications protéiques. Cette méthode peut théoriquement s’appliquer à tous les MNP avec des anticorps pour l’enrichissement tels que l’ubiquitination, la phosphorylation et d’autres. Il peut également s’appliquer à d’autres types de tissus ou modèles de culture cellulaire.
La clé pour obtenir des données précieuses en utilisant cette technique est la reproductibilité. Ceci peut être réalisé en s’assurant que toutes les étapes sont exécutées très soigneusement particulièrement les étapes impliquant les perles d’anticorps. Pour commencer, obtenez des cartouches contenant de la résine C18 qui combinent jusqu’à 10 milligrammes de protéines.
Placez ces cartouches dans un appareil à vide. Ajouter 800 microlitres de 80% d’acétylonitrile et 0,2% d’acide formique aux cartouches avec 19,8% d’eau et commencer l’aspiration sous vide pour tirer le liquide à travers. Répétez cette étape une fois en évitant complètement le séchage des cartouches.
Equilibrer les cartouches en ajoutant 800 microlitres d’acide 0,2% formic dans l’eau avec aspiration sous vide. Répétez ça deux fois. Chargez un milligramme de peptides dans environ 1000 microlitres sur les cartouches avec aspiration sous vide.
Laver les peptides deux fois avec 800 microlitres d’acide 0,2% formic dans l’eau sous aspiration sous vide. Disposer ensuite des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre sous chaque cartouche pour recueillir le peptide. Sous aspiration sous vide, peptides élumés des cartouches d’abord avec 800 microlitres de 80% d’acétylonitrile et 0,2% d’acide formique dans 19,8% d’eau puis avec 400 microlitres de la même solution.
Séchez complètement les échantillons de peptides desalted dans un concentrateur sous vide pendant deux à trois heures. Maintenant, resuspendez les peptides séchés dans 1,4 millilitres de tampon froid de purification de l’immunoaffinité 1X. Vortex pour mélanger et assurer un pH d’environ 7.
Centrifuger les échantillons à 10 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Une petite pastille apparaît. Mettre les peptides de côté sur la glace tout en préparant des perles d’anticorps.
Ajouter un millilitre de 1X PBS froid à un tube contenant 100 microlitres de boue de perle d’anticorps K-acétyl et un tube contenant 100 microlitres de boue de perle d’anticorps K-succinyl et mélanger au pipetage. Transférez toute la solution dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre et tournez dans une centrifugeuse miniature pendant 30 secondes à température ambiante. Aspirez le PBS en prenant soin d’éviter d’aspirer les perles.
Répétez le lavage trois fois de plus. Ensuite, resuspendez les perles dans environ 440 microlitres de PBS. Pipette les perles plusieurs fois pour bien mélanger.
Avec 200 pointes de précoupage de microlitres, transférez 100 microlitres de chaque perle d’anticorps d’acétyllysine et perles d’anticorps de succinyllysine dans un nouveau tube. Tournez vers le bas pendant 30 secondes dans une centrifugeuse miniature et aspirez hors du média avec une pointe de chargeuse de gel. Les perles deviennent maintenant blanches.
Pipette le peptide résuspendé directement sur les perles lavées et incuber les peptides avec des perles à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec agitation. Le matin, faites tourner les échantillons de peptide à 2000 fois g pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius. Retirez le supernatant contenant des peptides non liés et économisez pour de futures expériences si désiré.
Ajouter un millilitre de tampon froid de purification de l’immunoaffinité 1X aux perles pour les laver et les mélanger en inversant cinq fois. Tournez à 2000 fois g pendant 30 secondes à 4 degrés Celsius. Aspirez hors de la solution de purification d’immunoaffinité et répétez l’étape de lavage de purification d’immunoaffinité une fois de plus.
Ajouter ensuite un millilitre d’eau froide HPLC aux perles et mélanger en inversant cinq fois. Tournez à 2000 fois g pendant 30 secondes à 4 degrés Celsius. Aspirez hors de l’eau et répétez l’étape de lavage d’eau deux fois supplémentaires.
Faites tourner un temps supplémentaire à 2000 fois g pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius pour recueillir l’eau restante dans le fond du tube. Avec des pointes de chargement de gel à bout plat, aspirez toute eau supplémentaire qui se sont accumulées. Veillez à éviter d’aspirer les perles.
Ajouter 55 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,15 % dans l’eau aux perles. Incuber les perles pendant 10 minutes à température ambiante tout en tapant occasionnellement sur le fond du tube pour mélanger. Faites tourner les perles à température ambiante pendant 30 secondes dans une centrifugeuse miniature.
Utilisez une pointe de chargement de gel à pointe plate pour transférer les peptides élutés dans un nouveau tube. Ajouter 45 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,15 % dans l’eau aux perles. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante tout en tapant le fond du tube de temps en temps pour mélanger.
Faites tourner les perles à température ambiante pendant 30 secondes dans la centrifugeuse miniature. Retirez la deuxième élitution à l’aide d’une pointe de chargement de gel à pointe plate et combinez-la avec la première élitution. Faites tourner les peptides élités combinés à 12 000 g pendant cinq minutes à température ambiante pour granuler les perles qui se reportent.
Transférer la solution d’échantillon de peptide dans un nouveau tube de 500 microlitres. Construire la méthode de chargement pour charger les mélanges de peptides enrichis sur une puce pré-colonne C18 et désaltrer à nouveau les peptides en les lavant avec la phase A mobile à deux microlitres par minute pendant 10 minutes. Construire la méthode de chromatographie de telle sorte que les peptides sont transférés à une colonne analytique et elute à un débit de 300 nanolitres par minute avec un gradient de deux à trois heures en utilisant les phases mobiles A et B.Plus précisément, utiliser un gradient linéaire de 5%mobile phase B à 35% mobile phase B sur 80 minutes.
Par la suite, rampe de la phase B mobile à 80% sur cinq minutes, puis tenir à 80%B pendant huit minutes avant de revenir à 5%B pour un équilibrage de 25 minutes. Ensuite, créez une méthode d’instrument ms pour l’acquisition dépendante des données. Pour l’expérience 1, configurer ms1 précurseur ion scan de M / Z 400 à 1500.
Réglez la durée à 120 minutes. Créez une expérience IDA et cliquez sur OK. En vertu de l’onglet critères de commutation, fixez le seuil d’intensité pour déclencher des analyses de SP/SP pour les ions d’états chargés entre deux et cinq à 200 dénombrements par seconde. Réglez l’exclusion dynamique des ions précurseurs à 60 secondes.
Pour la deuxième expérience, réglez le scan iion du produit MS/MS avec une plage de balayage MS2 de M/Z 100 à 1 500. Cliquez sur modifier les paramètres et réglez la propagation de l’énergie de collision à cinq et sélectionnez le mode de balayage iion du produit à haute sensibilité. Enfin, placez l’échantillon dans l’autosampler.
Soumettez la file d’attente de l’échantillon et commencez les méthodes d’acquisition de LC-MS/MS en construisant une méthode d’instrument MS pour l’acquisition indépendante des données et en définissant deux expériences d’analyse d’instruments. Effectuez des balayages d’ion précurseur MS1 de 400 à 1 250 masse pour charger et régler la durée à 120 minutes. Réglez la propagation de l’énergie de collision à 10 et le temps d’accumulation à 45 millisecondes, puis sélectionnez le mode de balayage iion du produit à haute sensibilité.
Ensuite, importez un fichier texte contenant le système d’acquisition DIA SWATH à fenêtre variable de 64 fenêtres pour remplir les fenêtres d’acquisition SWATH dans la méthode. Dans ce schéma d’acquisition, les fenêtres variables allant de cinq à 90 masse à charger et la largeur sont passées en étapes incrémentielles sur la gamme de masse complète de 400 à 1, 250 masse à charger avec un total de 64 segments SWATH chacun avec un temps d’accumulation de 45 millisecondes. Réglez le temps d’accumulation MS1 à 0,25 seconde.
Ensemble, l’analyse MS1 et les 64 scans MS2 devraient maintenant donner un temps de cycle total de 3,2 secondes. Dans cette étude, les résultats expérimentaux ont documenté la possibilité de détecter et d’évaluer les discussions croisées sur la PTM. Ce tableau montre comment la chronologie du flux de travail et les quantités d’échantillon et de protéines nécessaires.
La méthode d’un pot peut être effectuée en deux fois moins de temps et avec la moitié du nombre d’échantillons que ces méthodes alternatives. Le coefficient médian de variation pour les zones peptidées modifiées était plus faible dans la méthode d’un pot que dans le PTM unique et l’enrichissement en série de PTM. Tout en comparant les méthodes d’enrichissement PTM et PTM à un pot, aucune différence notable n’était apparente entre les corrélations de la quantification au niveau du site pour les deux modifications.
Cette figure affiche les données d’un enrichissement réussi et illustre un exemple pour un peptide contenant des modifications acyl multiples et différentes visualisant le discours croisé de PTM. Un peptide a été acétylated sur un résidu de lysine et succilynated de l’autre tandis qu’ici le même peptide a été succilynated aux deux lysines. Cela démontre que le même résidu de lysine peut être modifié avec les deux groupes d’acylation et qu’il est possible que des discussions croisées se produisent à cet endroit.
Il est essentiel de s’assurer que chaque échantillon contient la même quantité de perles et de s’assurer qu’aucune des perles ne sont aspirées accidentellement lors du lavage des perles de liaison peptidique. Le profilage basé sur la spectrométrie de masse et l’analyse des données dans des outils logiciels tels que Spectronaut sont effectués à la suite de cette procédure afin d’identifier, quantifier et effectuer la localisation des MNP sur le site. Ce workflow d’acquisition indépendant des données, combiné à l’enrichissement simultané du PTM, ouvrira des voies pour évaluer plus efficacement les discussions croisées ptm et fournir de meilleurs aperçus de la pertinence de la signalisation PTM.
