La modification post translationnelle des protéines par la petite ubiquitine protéique est impliquée dans de nombreux événements dans la cellule. Cette étude présente un ajout original à la boîte à outils pour l’analyse de l’ubiquitination des protéines. Nous utilisons des techniques d’enrichissement et de spectrométrie de masse pour découvrir l’ubiquitinome profond.
Nous avons apporté plusieurs améliorations à l’analyse des peptides diGly qui proviennent de protéines ubiquitinées. Il s’agit notamment de la fractionnement du peptide brut avant l’enrichissement, et l’application de paramètres de fragmentation du peptide plus avancés dans l’Orbitrap. Au total, cela se traduit par une plus grande couverture de l’ubiquitinome.
Plusieurs aspects du protocole sont difficiles à décrire avec des mots. La visualisation de certaines des étapes clés est essentielle pour pouvoir répéter ces analyses par différents opérateurs dans un laboratoire différent. La procédure sera démontrée par Karel Bezstarosti, technicien senior dans mon laboratoire.
Commencez par préparer des cellules de culture ou des tissus cérébraux de souris pour l’expérience. Si vous travaillez avec des cellules, lyse la pastille cellulaire à partir d’une plaque de culture carrée de 150 centimètres en deux millilitres de froid glacé, 50 millimolaire Tris HCL avec 0,5% de désoxycholate de sodium. Faire bouillir le lysate à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Puis soniquez-le à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Si vous utilisez du tissu cérébral de souris in vivo, lyse-le dans un tampon glacé contenant 100 millimolar Tris HCL, 12 millimolar sodium désoxycholate et 12 millimolar sodium N-lauroylsarcosinate. Sonicate le lysate pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Puis faites-le bouillir pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius. Ensuite, quantifier la quantité totale de protéines à l’aide d’un kit d’analyse des protéines BCA d’absorption calorimétrique, qui devrait être d’au moins plusieurs milligrammes pour une immunoprécipitation réussie du peptide diGly. Pour les expériences SILAC, mélangez les protéines étiquetées légères et lourdes en un rapport un pour un basé sur la quantité totale de protéines.
Réduire toutes les protéines avec cinq millimolar DTT pendant 30 minutes à 50 degrés Celsius. Et par la suite les alkylate avec 10 millimolar iodoacetamide pendant 15 minutes dans l’obscurité. Ensuite, effectuez la digestion des protéines avec Lys-C pendant quatre heures.
Et la digestion de la trypsine pendant la nuit à 30 degrés Celsius, ou à température ambiante. Le lendemain, diviser l’échantillon en deux tubes Eppendorf de deux millilitres et ajouter le TFA à l’échantillon digéré à une concentration finale de 0,5% centrifugeuse à 10 000 fois G pendant 10 minutes pour précipiter et enlever tout détergent. Recueillir le peptide contenant du supernatant pour la fractionnement ultérieur.
Utilisez une chromatographie à pH inversée de phase C18 pour fractionner les peptides tryptiques. Préparez une cartouche vide de six millilitres remplie de 0,5 gramme de matériau de phase stationnaire pour environ 10 milligrammes de protéines digérées. Chargez les peptides sur la colonne préparée et lavez-les avec environ 10 volumes de 0,1 % d’AFE, suivis de 10 volumes d’eau.
Elute les peptides en trois fractions en utilisant 10 volumes de colonne de format ammonium millimolaire avec sept, 13,5 et 50% d’acétylisation, respectivement. Ensuite, litholyse toutes les fractions. Un lot d’anticorps de motif de restes d’ubiquitine conjugués à la protéine Agarose boue de perle est divisé en six fractions égales.
Dissoudre les trois fractions de peptide selon les instructions manuscrites et faire tourner les débris. Ajouter les supernatants des trois fractions au lisier de perles tout en gardant les trois autres fractions sur la glace. Et les incuber pendant deux heures à quatre degrés Celsius sur une unité de rotateur.
Ensuite, faites tourner les perles. Transférer le supernatant dans un lot frais de perles. Et répéter l’incubation avec les trois autres fractions de boue de perles.
Stockez les supernatants pour une analyse globale ultérieure du protéome. Et transférez les perles à 200 pointes de pipette microlitres équipées d’un bouchon de filtre GFF. Mettez les pointes dans des tubes de 1,5 millilitre équipés d’un adaptateur de pointe de centrifugeuse et lavez les perles trois fois avec 200 microlitres de tampon iap glacé, suivis de trois lavages avec de l’eau purifiée glacée.
Faites tourner les colonnes à 200 fois G pendant deux minutes entre les lavages, en vous assurant de ne pas laisser la colonne sécher. Après le lavage final, élitez les peptides avec deux cycles à 50 microlitres de 0,15% TFA. Desalt les peptides avec une pointe de stade C18 et les sécher avec centrifugation sous vide.
Effectuez des expériences LC-MS/MS sur un spectromètre de masse sensible couplé à un système de LC à nanoflow. La colonne est mise en place selon les instructions manuscrites et maintenue à 50 degrés Celsius. Actionner le spectromètre de masse en mode d’acquisition dépendant des données.
Collectez les spectres de masse MS1 à haute résolution grâce à un réglage cible automatisé contrôlé par gain de 4E5 et à un temps d’injection maximal de 50 millisecondes. Effectuez l’analyse de spectrométrie de masse dans le premier mode le plus intense, en utilisant la méthode de vitesse de pointe avec un temps de cycle total de trois secondes. Effectuez ensuite une deuxième série d’analyses de la SP DDA en premier mode le moins intense, ce qui assurera une détection optimale des peptides de faible abondance.
Filtrer les ions précurseurs en fonction de leurs états de charge et de leur affectation de pointe monoisotopic. Et exclure dynamiquement les précurseurs précédemment interrogés pendant 60 secondes. Isoler les précurseurs peptidiques à l’aide d’un filtre de masse quadrupole réglé sur une largeur de 1,6 Thomson.
Puis recueillir des spectres MS2 dans le piège i jion à un contrôle de gain automatisé de 7E3 avec un temps d’injection maximum de 50 millisecondes et l’énergie de collision HCD de 30%Analyser la spectrométrie de masse fichiers bruts à l’aide d’un moteur de recherche approprié, tels que la suite logicielle MaxQuant librement disponible basé sur le moteur de recherche Andromeda. Ouvrez MaxQuant et sélectionnez les fichiers de données brutes appropriés. Définissez le nombre de processeurs et cliquez sur l’onglet paramètres spécifiques du groupe.
Sélectionnez la digestion et prévoyez trois clivages manqués. Sélectionnez ensuite les modifications et ajoutez diGly aux modifications variables. Sélectionnez l’onglet paramètres mondiaux et ajoutez la base de données de séquence protéique correcte.
Laissez les autres paramètres par défaut et appuyez sur commencer à effectuer la recherche de base de données. Pour l’analyse quantitative des fichiers d’expérience SILAC, réglez la multiplicité à deux, et sélectionnez les étiquettes d’acides aminés lourds. Lorsque la recherche est terminée, importez les fichiers texte dans Persée.
Ce protocole a été utilisé pour identifier les sites d’ubiquitination dans les protéines des cellules de culture et du matériau in vivo en détectant les peptides diGly avec le nanoflow LC-MS/MS. Plusieurs améliorations ont été apportées au protocole existant, ce qui a entraîné un plus grand nombre de peptides diGly détectés. Une fraction brute en trois fractions a été exécutée avant l’immunoprécipitation.
L’une des fractions contient le peptide diGly tryptique modifié K48 de l’ubiquitine, qui se caractérise par un large pic dans le chromatogramme LC. En outre, le régime de fragmentation du peptide a été ajusté pour combiner les séries LC-MS avec les premiers et les plus bas régimes de fragmentation dans la procédure d’analyse des données, qui a produit plus de 4000 peptides diGly uniques supplémentaires. Plus de 23 000 peptides diGly peuvent être systématiquement identifiés à partir d’un seul échantillon de cellules HeLa traitées avec un inhibiteur protéasome.
De tous les peptides diGly identifiés sur trois écrans biologiques, plus de 9000 étaient présents dans les trois, tandis que plus de 17 000 étaient présents dans au moins deux répliques sur trois. Le nombre d’identifications peptidiques dépend fortement de la quantité de matériel d’entrée. On peut s’attendre à un nombre approximatif de peptides diGly identifiés selon le matériau de départ, mais ces chiffres ne sont que des estimations et dépendront également du type de spectromètre de masse utilisé.
Lors de l’exécution de ce protocole, l’expérience antérieure avec les méthodes protéomiques basées sur la spectrométrie de masse et la manipulation et l’analyse des quantités d’échantillons minuscules serait certainement avantageuse. Le logiciel MaxQuant pourrait être remplacé par n’importe quel autre algorithme de recherche de base de données. Un autre type de spectromètre de masse peut également être utilisé.
Les résultats en termes d’identifications peptidiques peuvent différer légèrement, mais c’est typique pour n’importe quel essai protéomique basé sur la spectrométrie de masse. L’ubiquitine est importante dans le progrès de la dégradation des protéines médiatisées, mais joue également un rôle dans de nombreux autres processus dans la cellule. Une connaissance plus approfondie de l’ubiquitine en tant que modification post translationnelle est cruciale pour mieux comprendre sa fonction.
