Cette méthode permet de compartimenter chaque arc pharyngéal. Les nombres de cellules endothéliales peuvent alors être quantifiés dans chaque arc comme moyen d’étudier le développement de l’artère arquée pharyngéale. Les principaux avantages de cette approche sont la capacité de visualiser la relation entre les différentes structures vasculaires et la capacité de déterminer quantitativement comment les structures ont affecté les mutants.
Les artères aortiques d’arc sont généralement mutées dans la maladie cardiaque congénitale. Notre méthode permet d’étudier comment les mutations modifient le processus physiologique de formation et de remodelage des vaisseaux. Bien que nous utilisions cette méthode pour obtenir un aperçu des mécanismes de la maladie cardiaque congénitale, elle peut être appliquée à d’autres systèmes particulièrement avec l’avènement de la microscopie de feuille de lumière.
Commencez par utiliser une pipette en verre pour transférer chaque embryon de souris 9,5 ou 10,5 embryons dans des tubes individuels de deux millilitres contenant un millilitre de PBS. Après la fixation, utilisez des forceps fins pour pincer soigneusement l’embryon juste au-dessus de l’agencé et faire une coupe transversale pour enlever la moitié postérieure de l’embryon. Pour perméabiliser les embryons, remplacez le PBS par le PBST et placez les embryons à quatre degrés Celsius par une légère agitation pendant la nuit.
Le lendemain, remplacez le PBST par 600 microlitres de tampon bloquant sans toucher les embryons pour une incubation de 16 à 18 heures à quatre degrés Celsius avec une légère agitation. Le lendemain matin, remplacez le tampon de blocage par 600 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt par tube pour une incubation de quatre à cinq jours à quatre degrés Celsius par une légère agitation. À la fin de l’incubation, laver les embryons en un millilitre de PBST pendant quatre à cinq heures avec une agitation douce à température ambiante en changeant le PBS toutes les heures, suivie d’une incubation d’une nuit en PBST frais à quatre degrés Celsius et de quatre à cinq lavages supplémentaires d’une heure le lendemain.
Après le dernier lavage, remplacer le PBST dans chaque tube par 600 microlitres de la solution d’anticorps secondaire appropriée pour une incubation de quatre à cinq jours à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver les embryons en un millilitre de PBST frais par lavage comme il vient de le démontrer et utiliser une pipette en verre pour transférer doucement chaque embryon dans des moules individuels en plastique paraffine. Retirez soigneusement n’importe quel PBST autour de chaque embryon et orientez chaque embryon dans une position sagittale.
Ajoutez ensuite rapidement environ 500 microlitres d’agarose chaude à chaque moule jusqu’à ce que chaque embryon soit juste couvert et placez les moules sur la glace couverte de papier d’aluminium jusqu’à ce que l’agarose se soit solidifiée. Pour la déshydratation des échantillons embryonnaires, utilisez un scalpel propre pour couper un bloc d’agarose autour de chaque embryon et utilisez des forceps pour saisir l’agarose pour le transfert dans un tube de deux millilitres étiqueté contenant un millilitre de 25% de méthanol. Après une incubation d’une heure avec agitation douce dans l’obscurité, remplacez 25% de méthanol par un millilitre de 50% de méthanol par tube pour une incubation supplémentaire d’une heure dans l’obscurité.
Après la fin de la déshydratation, remplacer le 100% méthanol par un millilitre de 50% BABB pour une incubation d’une heure avec une agitation douce dans l’obscurité. À la fin de l’incubation, remplacer le BABB à 50 % par un millilitre de 100 % BABB par tube pour une incubation d’une heure par une agitation douce dans l’obscurité, suivi d’une deuxième incubation avec 100 % BABB comme nous venons de le démontrer. Pour monter les embryons pour l’imagerie, retirez l’adhésif d’un pare-chocs de puits rapide et placez le pare-chocs sur un 24 par six millilitres numéro 1,5 couverture en verre.
Appliquez une pression douce sur l’adhésif pour enlever les bulles d’air entre le coverslip et le pare-chocs et jetez soigneusement le 100% BABB de chaque tube. Ensuite, utilisez des forceps fins pour transférer soigneusement l’embryon dans le puits rapide sans toucher l’embryon et placer un deuxième coverslip sur le pare-chocs. Pour faire surface l’endothélium dans l’ensemble du troisième arc pharyngéal, ouvrez l’image d’intérêt pour le logiciel et cliquez sur ajouter une nouvelle surface.
Double-cliquez sur la surface un et renommer la nouvelle surface en troisième arc pharyngéal. Sélectionnez sauter la création automatique, modifier manuellement et définir l’orientation de surface vers le plan YZ. Utilisez la position de la tranche pour placer le troisième plan de surface de l’arc pharyngeal à l’endroit où le troisième PAA et l’aorte dorsale se connectent.
Faites pivoter l’image de sorte que le troisième plan de surface de l’arc pharyngeal soit en vue et éteignez l’ortho trancheur. Sous le mode contour de dessin, sélectionnez la fonction de mode de dessin à distance et ajustez les paramètres au besoin. Lorsque tous les paramètres ont été définis, appuyez sur la touche Escape et cliquez sur dessiner pour tracer le périmètre de la troisième arche pharyngéale avec le curseur de la souris.
Ensuite, utilisez la position de la tranche pour déplacer 10 à 25 tranches et tracer le périmètre de l’arc pharyngéal. Lorsque l’arc entier a été tracé, cliquez sur créer de la surface pour générer la surface de la région tracée. Pour masquer les structures en surface, dans le menu modifier, sélectionnez la sélection des masques pour le troisième PAA et DAPI et cliquez sur OK. Renommez ensuite le nouveau canal sous le nom de PAA DAPI.
Répétez cette étape pour les canaux restants. Pour visualiser le plexus endothélial séparément de l’AAP, sélectionnez la sélection du masque pour la troisième AAP et sélectionnez DAPI. Décochez certains voxels extérieurs à la surface extérieure et vérifiez certains voxels à l’intérieur de la surface.
Réglez certains voxels à l’intérieur de la surface à zéro et cliquez sur OK. Renommer le nouveau canal comme non-PAA DAPI. Répétez cette étape pour les canaux restants. Sélectionnez la sélection du masque pour la troisième PA et sélectionnez NON-PAA DAPI et cliquez sur OK. Renommez le nouveau canal en plexus DAPI.
Répétez cette étape pour les canaux restants. Pour quantifier les cellules endothéliales individuelles dans chaque structure d’intérêt, dans le panneau de réglages d’affichage, éteignez tous les canaux à l’exception du canal PAA ERG. Dans le menu propriétés, cliquez sur ajouter de nouveaux spots et cliquez pour renommer les taches un nombre total de cellules endothéliales PAA.
Cliquez sur la flèche bleue et sélectionnez le canal PAA ERG pour le canal source. Ajustez le diamètre XY estimé à quatre micromètres et cliquez sur la flèche bleue pour passer au panneau suivant. Utilisez l’échelle coulissante pour ajuster le nombre de taches pour vous assurer que chaque noyau de cellule endothéliale positif ERG est représenté par un seul endroit.
Ensuite, cliquez sur la double flèche verte et éteignez le canal PAA ERG dans le panneau d’ajustement d’affichage. Activez le canal PAA VEGFR2 pour visualiser l’endothélium PAA et cliquez sur modifier et ajouter/supprimer pour sélectionner la surface de l’objet. Appuyez ensuite sur Escape et maintenez Shift pour supprimer les taches qui ne sont pas positives vegfr2 et cliquez sur l’onglet statistiques pour déterminer le nombre total de cellules endothéliales.
L’immunofluorescence entière de montage produit des résultats clairs et propres permettant la reconstruction 3D de l’endothélium pharyngeal d’arc. Dans cette image, la présence des gros points lumineux est le résultat de particules dans les solutions tampons anticorps ou bloquantes. Après la coloration de surface de l’arc pharyngeal et de la PAA, l’utilisation de la fonction masque permet aux régions en surface d’être visuellement séparées et analysées indépendamment.
Le masquage permet également l’analyse individuelle et la quantification des numéros de cellules endothéliales dans chaque structure. Par exemple, ici, la fonction spot a été utilisée pour quantifier le nombre total de cellules endothéliales dans l’AAP et le plexus en attribuant un seul point pour chaque noyau exprimant ERG. Dans cette image, un spot négatif VEGFR2 positif ERG qui a été généré par la fonction spot peut être observé.
Par conséquent, il est essentiel de vérifier que chaque point reconnu par le logiciel représente en fait une seule cellule endothéliale. Pour obtenir des images propres et claires, n’oubliez pas de faire tourner toutes les solutions et de bien laver chaque embryon après les incubations d’anticorps. Il est important de se rappeler que babb est corrosif et toxique.
Manipulez et jetez le solvant correctement et assurez-vous de sceller complètement les embryons fondus pour éviter les fuites de BABB.
