Les auteurs remercient les membres passés et présents de nos laboratoires qui ont aidé à développer ces techniques. Un financement partiel prévu pour DE par une subvention de l&#39;Institut de la Californie pour la médecine régénérative / CIRM (RN1-00538).

1. Poisson zèbre élevage, Embryon génération, et le traitement <ol><li> Effectuer les protocoles de poisson zèbre suivants sous la direction d&#39;un soin des animaux et l&#39;utilisation comité institutionnel (IACUC) et dans les directives de protection des animaux du NIH ou d&#39;autres organes / directives réglementaires. </li><li> Souches de poisson zèbre qui expriment des protéines fluorescentes dans des tissus spécifiques, les cellules ou d&#39;organes sont disponibles auprès du Centre de ressources international poisson zèbre (ZIRC). Par exemple, Tg (kdr: EGPF) S843 exprimer EGFP dans les cellules endothéliales vasculaires 6, qui peuvent être utilisés pour produire des structures vasculaires 3D complètes, comme indiqué dans ce protocole. D&#39;autres lignes de poisson zèbre transgénique sont disponibles à partir ZIRC. </li><li> Maison de poisson zèbre adulte dans un système d&#39;aquaculture approprié qui surveille le pH, la salinité, la température, l&#39;oxygène dissous, la lumière, et d&#39;autres facteurs environnementaux 7. Le poisson zèbre montré ici ont été logés dans un système Aquaneering Inc. (San Diego, CA) à 28,5 ° C avec une lig 14 heuresht/10 heures cycle d&#39;obscurité. Nourrir le poisson zèbre adulte une alimentation équilibrée de la crevette de saumure et la BDNI 4/6 poisson alimentaire (Brine Shrimp Direct, Ogden, Utah). </li><li> Le mâle adulte et le poisson zèbre femme en âge de reproduction devraient être hébergés séparément pour augmenter l&#39;accouplement. </li><li> Stimuler la ponte et la fécondation en plaçant les femelles (2-4) et les hommes (4-6) ensemble dans un récipient d&#39;accouplement qui a un fond de maille avec des trous assez grands pour que les oeufs tombent à travers, mais trop petit pour les adultes de poisson zèbre à passer . Mettre en place des accouplements la veille; les œufs sont pondus près de l&#39;aube, généralement tout le cycle de lumière de jour augmente lentement en intensité (l&#39;aube). Vérifier la liste des oeufs au fond du récipient d&#39;accouplement toutes les 15-30 minutes. </li><li> Ramassez les œufs à l&#39;aide d&#39;une passoire et propre avec un tampon E3 (5 mM de NaCl, KCl 0,17, 0,33 mM de CaCl2 0,33 mM MgSO 4). Transférer les œufs à 100 plaques de culture mm remplis de tampon E3 et magasin dans un incubateur à 28 ° C. </li><li> Pour étudier les produits chimiques qui modifient cerebrovascular ramification ajouter concentrations chimiques désirées. Par exemple neovasular ramification peut être induite par un inhibiteur γ-sécrétase (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-ester phenylglycinet-butyl) solubilisé dans du DMSO 4, en commençant 24 heures après la fécondation (HPF). À ce moment-points embryons sont encore dans le chorion, et de nombreux produits chimiques peuvent traverser 8. Si une condition de traitement a neuronaux ou moteur effets qui peuvent nuire à la capacité des embryons de se libérer du chorion, alors embryons doivent être dé-chorionated entre 24 et 48 HPF, qui peut être fait soit avec une pince de pronase 2. Embryons figurant dans les images fournies ont été dechorionated en saisissant doucement le chorion avec deux pinces acérées et déchirer ouvert. </li><li> Si nécessaire / on le souhaite, la formation de pigment peut être inhibée par l&#39;ajout de 0,003% de N-phénylthiourée (PTU) à la mémoire tampon E3 à 24 hpf. </li></ol> 2. Imagerie confocale de cérébrovasculaire Structres en fixe embryons de poisson zèbre <ol><li> Sacrifier des embryons dans 250 mg / L Tricaine méthanesulfonate, puis les fixer par immersion dans de 2 - 4% de paraformaldéhyde pendant une nuit à 4 ° C. Conteneurs avec des embryons fluorescents doivent être enveloppés dans du papier. Une fois fixée, les embryons doivent être conservés dans du PBS à 4 ° C jusqu&#39;à imagée - EGFP intensité de fluorescence devient moins résolu après environ une semaine, mais la morphologie (vu dans le domaine lumineux) est conservée beaucoup plus longtemps. </li><li> Préparer pour monter l&#39;embryon en retirant d&#39;abord un œil à l&#39;aide d&#39;une aiguille de tungstène aiguisées. Couper autour du tissu conjonctif de l&#39;œil d&#39;abord, puis couper les muscles, et enfin couper le nerf optique pour déplacer l&#39;œil. (Remarque: Si l&#39;imagerie supprimer deux côtés on veut les deux yeux.) </li><li> Une fois l&#39;œil est enlevé, monter l&#39;embryon sur une lamelle en utilisant une baisse de 3% de méthylcellulose. Orienter l&#39;embryon ainsi que le côté avec l&#39;œil enlevé est confrontée à la lamelle et est aussi proche de la vitre que possible. Couvrir l&#39;ensemble embryon méthyllcellulose pour éviter la dessiccation pendant la formation d&#39;image. </li><li> L&#39;image de l&#39;embryon monté immédiatement en utilisant un microscope confocal inversé équipé d&#39;un objectif de haute qualité 20x Plan Apo (ouverture numérique = 0,75 ou mieux). Cette configuration est préférable à un microscope non-inversée qui exigerait l&#39;embryon en sandwich entre deux plans de verre, et en appuyant sur l&#39;embryon contre la vitre supérieure. </li><li> Recueillir tranches optiques dans une um incréments l&#39;aide d&#39;un réglage d&#39;ouverture moyenne ou grande. Les grandes étapes de 2,5 um peuvent également être utilisés, mais il peut être plus difficile de déterminer l&#39;ordre spatial de petits objets. Petites ouvertures produisent des détails plus précis, mais les analyses plus nécessaires peuvent blanchir EGFP et aussi de limiter la profondeur de l&#39;imagerie dans l&#39;embryon qui peut être atteint. Un microscope confocal permet une imagerie à mi-chemin à travers un embryon. </li><li> Si l&#39;imagerie du poisson entier, enlever les deux yeux au début (voir la note à l&#39;étape 3.2), tourner l&#39;embryon après Imaging un côté et répétez les étapes 2.3 à 2.5 pour le côté opposé. </li></ol> 3. Reconstruction 3D de poisson zèbre embryonnaire Cerebrovasculature <ol><li> Utilisez la distribution Fidji 3 de l&#39;open source ImageJ (http://fiji.sc), qui est optimisé pour les rendus 3D, gratuit et compatible avec PC, Mac et Linux. </li><li> Importation piles confocale à Fidji en allant à Plug-ins&gt; LOCI&gt; BioFormats Importateur 9, puis sélectionnez le fichier confocale, par exemple name.ids pour piles Nikon (figure 2A). Sélectionnez Afficher pile avec le mode HyperStack, Couleur: gris, consultez l&#39;échelle automatique, consultez canaux divisés. </li><li> Ces sélections ouvrir quatre panneaux de canaux séparés; pour EGFP seul sera nécessaire, habituellement le troisième vers le bas. Fermez les trois autres panneaux (rouge, bleu et alpha) laissant l&#39;image 16 bits avec un nom long suivi par C = 1 (figure 2A). </li><li> Régler le seuil de balayage si l&#39;image en utilisant le défilement tab le long du fond pour trouver une tranche qui a la région ou de la structure d&#39;intérêt, puis aller à Image&gt; Réglages&gt; Seuil (figure 2C). </li><li> Dans le panneau qui s&#39;affiche, faites glisser la barre du haut (niveau de noir) vers la gauche de sorte que la structure peut être bien vu sur fond, et laisser la lame de fond (niveau de blanc) où il est (figure 2D). Sélectionnez B &amp; W, sélectionnez fond foncé. Ne sélectionnez pas de seuil de calculer pour chaque image moins que d&#39;autres ajustements sont nécessaires pour chaque tranche, sélectionnez fond noir. Ce processus crée une nouvelle image 8 bits. </li><li> AVERTISSEMENT: Seuil ne peut être annulée ou enregistré dans ImageJ, si la pile confocale devra être rechargé à chaque fois qu&#39;un changement est nécessaire. Notez les numéros et essayer différents réglages jusqu&#39;à ce que le résultat escompté est atteint. </li><li> Aller au Plug-ins&gt; 3D Viewer&gt; Seuil 0, rééchantillonnage facteur 1 (meilleur) ou 2 (bien), désactivez les cases rouges et bleu pour faire une sortie 3D vert - sinon il will produire un rendu blanc - sélectionnez Appliquer (non automatique) (figure 2E). </li><li> Tourner, tourner et agrandir l&#39;image 3D à l&#39;aide de la souris et des commandes clavier (figure 2F). </li><li> Enregistrer des images fixes à n&#39;importe quel moment en utilisant l&#39;option de capture dans le menu. La taille de la boîte de l&#39;image sur l&#39;écran dicte dimensions en pixels de l&#39;image produites si une image haute résolution est désirée marque la grande boîte en faisant glisser le coin inférieur droit. </li><li> Créer un film filature 3D en sélectionnant Affichage&gt; Enregistrer une rotation de 360 ° (figure 2G). Rotation par défaut à 2 degrés par étape, mais il peut être modifié à 5 degrés par exemple, ce qui créera des tailles de fichiers beaucoup plus petits, mais peuvent ajouter saccades de l&#39;animation. </li><li> Enregistrez le fichier dans l&#39;un des nombreux formats disponibles pour les visionner plus tard avec les lecteurs multimédias, les télécharger sur Internet, ou à l&#39;aide de présentations PowerPoint. Le lecteur multimédia open source, VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">ht</a>tp :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), est gratuit et gère ces vidéos très bien. </li></ol>

<ol>
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J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272 (2012).</li></ol>

Il n&#39;y a rien à divulguer.

Les méthodes décrites ici constituent une base pour les études visuelles du système vasculaire dans le développement du poisson zèbre. Spécimens vivants peuvent être utilisés pour évaluer les paramètres physiologiques tels que la fréquence cardiaque et du volume systolique cardiaque, tandis que les échantillons fixes peuvent être utilisés pour l&#39;imagerie confocale à haute résolution. Drosophile et C. elegans pour permettre l&#39;imagerie du corps entier, mais le poisson zèbre sont des vertébrés et de fournir un modèle utile pour les tissus de vertébrés, y compris un système vasculaire endothelial cell-doublé. Ces études peuvent intégrer lignées transgéniques d&#39;importantes ressources génomiques et de la communauté de recherche du poisson zèbre. Reconstruction 3D et le rendu des images confocales de poisson zèbre embryonnaire, tel que décrit ici, permettre une approche de biologie des systèmes à ramification vasculaire et la densité des vaisseaux sanguins qui n&#39;est pas possible avec des modèles animaux plus grands tels que les rats et les souris. En outre, comme le poisson-zèbre amniotes développer dans un environnement modifiables (tampon E3), où l&#39;on peut facilement ajouter cHIMIE qui inhibent les enzymes spécifiques ou d&#39;autres processus qui affectent le développement vasculaire. La concentration et le calendrier de livraison des produits chimiques peuvent être modifiés, permettant le chercheur de conditions de traitement pour affiner. 1. Modifications et dépannage Toute modification de ce système peuvent intégrer des lignées transgéniques de poisson zèbre qui expriment des protéines fluorescentes EGFP ou autres dans une variété de modèles spécifiques de 10 tissus, organes ou région. En outre, l&#39;analyse des changements néovasculaire de la rétine de poisson zèbre a été récemment publié 5. Problèmes avec la pigmentation dans les embryons de poisson zèbre âgés et les adultes peuvent être compensées par croisement avec des lignées transgéniques qui ne produisent pas de pigments à l&#39;échelle ou pigmentaire rétinien. Problèmes avec la fluorescence diminuée entraînent généralement des conditions de fixation inappropriés. Paraformaldéhyde (4%) pour un jour est optimale, mais fixateurs forts, tels que le glutaraldéhyde, tétroxyde d&#39;osmium ou de l&#39;alcool, peutdétruire la fluorescence de l&#39;EGFP. Après fixation, les embryons doivent être conservés dans du PBS à 4 ° C et toujours protégés des rayons du soleil. 2. Limites de cette technique La qualité et la résolution de rendus 3D produites avec ce protocole dépendent de la qualité des images générées. Pénétration de la lumière à travers ces embryons est limitée par rapport au plan sagittal médian à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal standard. Cet aspect de l&#39;imagerie limite la profondeur de l&#39;imagerie dans les embryons âgés et les adultes, mais les systèmes de microscopie multi-photons les plus avancées pour l&#39;imagerie permet à de plus grandes profondeurs. 3. Importance par rapport aux méthodes existantes Ce protocole prévoit une approche de l&#39;analyse des réseaux de vaisseaux sanguins au niveau des systèmes qui peuvent intégrer un animal entier. Représentations antérieures de ces données sont souvent appuyés sur des séries d&#39;images disposées ensemble, mais le rendu 3D offre une meilleure résolution de la relation spatialetionships impliqués. 4. Applications futures Nouveaux développements dans l&#39;imagerie et le traitement des tissus fourniront de nombreuses nouvelles applications pour ces méthodes qui peuvent inclure faire embryons plus âgés ou adultes transparent 11-14. Transparence accrue permettra d&#39;accroître considérablement la pénétration des tissus par des lasers confocale et multi-photons. En outre, comme la vitesse de caméras et des tubes photomultiplicateurs à augmenter rapidement, il peut être possible de produire des rendus 3D de poissons, en temps réel, fournissant une 4 ème dimension de l&#39;analyse. 5. Étapes critiques Une étape cruciale dans ce protocole est la préparation pour l&#39;imagerie, qui comprend la fixation correcte. L&#39;imagerie doit être fait dès que possible après la fixation des objectifs de haute qualité qui ont les meilleures ouvertures numériques disponibles. Résolution dépend du système d&#39;imagerie utilisé, les systèmes afin de haute qualité sont généralement mieux. Génération des rendus 3D beaucoup de mémoirepour les nouveaux, de sorte que les ordinateurs haut de gamme avec une grande quantité de mémoire et de bons processeurs graphiques sont recommandées. Le système de la biologie visuelle décrite ici a été optimisé pour le poisson-zèbre transgénique qui exprime l&#39;EGFP dans les cellules endothéliales vasculaires, bien que ces procédés peuvent être adaptés à des embryons transgéniques qui expriment la GFP, ou d&#39;autres protéines fluorescentes, dans des populations de neurones, les muscles, les glandes ou un nombre quelconque de d&#39;autres cellules. Le principal avantage de travailler avec ce système est la possibilité d&#39;étudier ce qui se passe dans tout l&#39;embryon à tout moment pendant cette période de développement, chez les animaux fixes et / ou en direct.

Poisson zèbre fournir un système puissant pour étudier la biologie du développement, et la relative transparence de leurs embryons se prête à des études fondées sur l&#39;imagerie 1. Le poisson zèbre a été utilisé comme un modèle pour le développement des vertébrés pendant des décennies. Téléostéens, y compris le poisson-zèbre, ont un système vasculaire vertébré simplifiée qui n&#39;a pas homologue raisonnable chez les invertébrés. Le sang est pompé à partir de la chambre antérieure d&#39;un coeur à deux chambres par des branchies, où il est oxygéné. Le sang des branchies converge à l&#39;aorte dorsale et passe à travers les artères qui se ramifient en vaisseaux plus petits et plus petits, éventuellement capillaires profonds dans des tissus d&#39;organes. De capillaires oxygène est libéré et le dioxyde de carbone est absorbé. Du côté veineux de capillaires flux sanguin dans les veines plus en plus grandes et est finalement aspiré dans la chambre postérieure du cœur, où le cycle se répète. Un poisson zèbre adulte peut pondre plus de 200 œufs à la fois, et once fécondé, ils développent rapidement 2. Après une journée de l&#39;axe du corps est bien développé, y compris les muscles ce contrat et se déplacent à l&#39;intérieur de l&#39;embryon la membrane chorionique. De 2-7 jours après la fécondation (DPF) la plupart des systèmes de l&#39;organisme à développer, y compris les yeux et un système nerveux central qui peuvent coordonner nageant vers la nourriture ou à l&#39;écart de la lumière vive. Jusqu&#39;à sept embryons de dpf sont suffisamment petites pour permettre la visualisation par microscopie. Les lignées transgéniques qui expriment des protéines fluorescentes peuvent être imagées par microscopie confocale ou fluorescence. Imagerie confocale peut être couplé avec un logiciel open-source 3 pour créer des rendus 3D de structures vasculaires complets dans embryons de poissons zèbres qui offrent un point de vue des systèmes de biologie du développement vasculaire. Études concernés par des changements dans la complexité vasculaire et cérébro-vasculaire bénéficieront de ce protocole, car elle permet une analyse au niveau des systèmes de réseaux vasculaires 4,5. Une compilation des méthodes et des ressources sont de fournird pour permettre l&#39;adoption simple et de ces techniques pour les études qui nécessitent l&#39;imagerie des structures vasculaires chez le poisson zèbre embryonnaire. Le rapport coût-efficacité de poisson zèbre comme modèle animal est de combiner les technologies émergentes d&#39;imagerie pour fournir de nouvelles plates-formes permettant d&#39;évaluer les effets angiogéniques de voies moléculaires dans le développement des vertébrés et de l&#39;homéostasie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr>
			<td>N &#8211; Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, catalog #41972</td>
			<td></td>
			<td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Mat-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSI IX/DAPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td>
			<td></td>
			<td>BD Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>VWR,&#160; cat #414004-001</td>
			<td></td>
			<td>VWR disposable transfer pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, cat#43146</td>
			<td></td>
			<td>3% in E3 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRD 4/6 Fish food&#160;</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Dried</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Live</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire&#160;</td>
			<td>Small Parts # TW-016-60</td>
			<td></td>
			<td>0.016&#8221; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>VWR # 101107-950</td>
			<td></td>
			<td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

Poisson zèbre constituent un outil puissant pour étudier la biologie du développement et de la pathologie in vivo. La petite taille et de la transparence relative des embryons de poisson zèbre les rendent particulièrement utiles pour l&#39;examen visuel des procédés tels que le cœur et le développement vasculaire. Dans plusieurs études récentes Poisson-zèbre transgénique qui exprime l&#39;EGFP dans les cellules endothéliales vasculaires ont été utilisés pour analyser l&#39;image et des réseaux vasculaires complexes dans le cerveau et de la rétine, en utilisant la microscopie confocale. Les descriptions sont fournies à préparer, traiter et l&#39;image embryons de poisson zèbre qui expriment la protéine fluorescente verte (EGFP), puis de générer des rendus 3D complets du système vasculaire cérébral. Protocoles comprennent le traitement des embryons, l&#39;imagerie confocale, et les protocoles de fixation qui préservent la fluorescence de l&#39;EGFP. En outre, des conseils utiles sur l&#39;obtention d&#39;images de haute qualité des structures vasculaires cérébraux, tels que l&#39;élimination de l&#39;œil sans endommager les tissus nerveux à proximité sont fournies. Les pièges à éviteravec l&#39;imagerie confocale sont discutés, ainsi que les mesures nécessaires pour générer des reconstructions 3D à partir de piles d&#39;images confocale en utilisant librement les logiciels open source.

Reconstruction 3D de structures vasculaires fournit une perspective globale et visuellement intéressant de développement du poisson zèbre. Figures 1 et 2 montrent que les méthodes qu&#39;ils généralement effectuées. Figure 3 montre plusieurs angles de structures vasculaires dans une 6 dpf embryon de poisson zèbre qui a exprimé EGFP dans les cellules endothéliales. Avec une couleur verte ou blanche solide, il peut être difficile d&#39;apprécier l&#39;intensité du signal; pseudo-coloration fournir intensité de l&#39;image à partir d&#39;une consultation table et permet une meilleure perception de la profondeur où les structures se chevauchent. Un exemple d&#39;une image en 3D de pseudo-couleur de la vascularisation dans un 6 dpf poisson zèbre est fourni à la figure 4. Fluorescence imagerie d&#39;embryons vivants peut être utilisé pour étudier des caractéristiques physiologiques qui comprennent l&#39;œil et le mouvement du corps, et l&#39;activité cardiaque. Figures 3 et 4 montrer des résultats représentatifs obtenus avec ces méthodes, en utilisant la ligne de poisson zèbre transgénique<html> décrit. résolution d&#39;imagerie dépend des caractéristiques du microscope, mais la luminosité du signal EGFP est suffisante pour une bonne qualité d&#39;image avec la plupart des systèmes commerciaux. La reconstruction et le rendu des représentations 3D est cohérente et options dans ce logiciel open-source offrent toujours de bons résultats. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> Figure 1. Élimination des yeux. A) fixe 3 dpf embryon avec un besoin de tungstène placé à côté de l&#39;œil. Tissu est coupé autour de l&#39;oeil de cette position. B) L&#39;œil est tombe et les muscles oculaires sous-jacents et du nerf optique sont coupés. L&#39;orbite vide est indiqué avec le cercle en pointillés. C) Le même embryon est retourné et monté avec méthyl-cellulose, à l&#39;œil intact vers le haut.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> Figure 2. Étape par étape de la reconstruction en 3D d&#39;une pile d&#39;images confocale. A) Ouvrir le fichier (4104.1.ids) chargé dans Fidji utilisant Plug-ins&gt; LOCI&gt; BIOFORMAT pour sélectionner. B) Après avoir trouvé une tranche de la zone d&#39;intérêt, le réglage de seuil est choisi comme indiqué. C) Le seuil est ajusté à 214 en utilisant le haut curseur et appliquer est sélectionné. spectateur D) 3D est appelé comme indiqué. E) La reconstruction 3D est représenté d&#39;un poisson zèbre à l&#39;œil intact, pour l&#39;orientation. F) L&#39;image a été agrandie et rotation. G) Un film de rotation de 360 degrés est faite comme indiqué.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> Figure 3. Perspectives de reconstruction 3D. A) point de vue médiale de 6 dpf embryon imagé avec objectif 10x, la bouche est sur ​​la droite, et non pas à l&#39;intérieur de la bouche branchies. B) latérale de la même embryon, la note nageoire est une boucle au milieu. C) même embryon imagé avec 20x objectif, perspective interne, la résolution des branchies de la note. D) perspective latérale de 20x imagerie objective. La nageoire est sur ​​le bord droit de l&#39;écran. E) vue antéro-médial de 20x imagerie objective, les branchies des notes à l&#39;intérieur de la bouche. F) L&#39;abdomen de la même embryon imagé avec un objectif 20x, tête vers la droite. Remarque vasculaire sur le sac jaune en bas à droite.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> Figure 4. Différences d&#39;intensité dans 6 dpf embryon. Image d&#39;une reconstruction de 6 dpf utilisant un pseudo-consultation-table pour l&#39;intensité du signal. Bouche, le cerveau, les branchies et sac de jaune sont marqués pour orientation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> Figure 5. Film du système vasculaire reconstruit dans un poisson-zèbre 4 dpf. Le poisson a été imagée à 2,5 um. Les images ont étéà partir de l&#39;imagerie de la moitié de l&#39;embryon. Comparer les structures vasculaires avec des structures dans un poisson zèbre GSI-traitée prévus dans la figure 6. Notez la densité plus faible des vaisseaux sanguins dans la tête et plus grandes branchies. (Voir le &quot;Zfish_spin.avi&quot; fichier supplémentaire sous Téléchargements) <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> Figure 6. 3D Movie du système vasculaire dans un embryon GSI-traitée à 4 dpf. Le poisson a été imagée à 2,5 um par de latéral à la ligne médiane. Comparer structures vasculaires avec le contrôle 4 dpf poissons montre la figure 5. L&#39;dos voûté et une plus petite taille sont typiques dans les embryons traités avec ce produit chimique. (Voir le «GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; fichier supplémentaire sous Téléchargements)

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Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Imagerie du développement vasculaire cérébral chez le poisson zèbre larvaire est décrite. Techniques pour faciliter l&#39;imagerie 3D et modifier le développement vasculaire cérébral en utilisant des traitements chimiques sont également fournis.

Imagerie et de reconstruction 3D de structures vasculaires cérébraux embryonnaires poisson zèbre

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.7K vues.  Western University of Health Sciences.  Imagerie du développement vasculaire cérébral chez le poisson zèbre larvaire est décrite. Techniques pour faciliter l'imagerie 3D et modifier le développement vasculaire cérébral en utilisant des traitements chimiques sont également fournis. 

Vidéo: Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Recherche

Biologie

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tissu ciblé chimères embryonnaires: Zebrafish cellulaire Gastrula transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdissection de tissus embryonnaires Zebrafish Eye

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunocoloration des Disséqué coeur embryonnaire Zebrafish

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-infligé des blessures de poisson zèbre muscle squelettique embryonnaire

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopie intravitale pour l&#39;imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

En direct d&#39;imagerie cellulaire et l&#39;analyse 3D des antagonistes des récepteurs de type 1a traite des transfectées embryonnaires humaines cellules rénales Utilisation Microscopie confocale