Ce protocole normalise de nouvelles techniques d’analyse tissulaire afin qu’elles puissent être plus largement utilisées par d’autres groupes qui étudient également les malformations cardiaques congénitales. Comme les techniques d’analyse qualitative et quantitative ont leurs avantages et leurs inconvénients, cette méthodologie utilise les deux pour répondre à la plus large gamme de questions expérimentales. Ces techniques peuvent avoir un impact positif sur les méthodes de diagnostic cardiologie.
Par exemple, les pathologistes pourraient appliquer nos techniques microscopiques d’analyse des tissus cardiaques pour diagnostiquer les maladies cardiaques humaines à partir d’échantillons de biopsie. Ce protocole peut être utilisé pour la cardiologie développementale ou la recherche en cardiologie générale. Cependant, ces méthodes fournissent également diverses techniques utiles qui peuvent être appliquées à n’importe quelle analyse tissulaire.
Pour recueillir le jour embryonnaire 15 à 15.5 coeurs, fixez les membres d’une mère enceinte et commençant autour de l’urètre jusqu’au sternum, faites soigneusement une incision en forme de I le long du torse. À l’aide de forceps dans un mouvement de scooping, soulevez doucement l’utérus hors de la cavité abdominale saisissant les tissus superficiels de l’utérus si nécessaire avec des forceps fins pour aider à l’extraction. Utilisez des ciseaux pour libérer l’utérus de l’abdomen.
Après avoir trempé l’utérus dans du PBS glacé, épinglez l’organe dans un plat de dissection. À l’aide de ciseaux, couper l’utérus en sections individuelles contenant chacune un embryon distinct. À l’aide de deux paires de forceps fins, peler délicatement les embryons du tissu utérin et les placer dans une nouvelle boîte de Pétri contenant quatre degrés Celsius PBS-EDTA.
Pour recueillir les cœurs, placez le plat sous un microscope disséquant et utilisez deux paires de forceps fins pour positionner l’embryon dans la position de supination. Après avoir stabilisé l’accès à la poitrine, utilisez le point pointu d’une deuxième paire de forceps fins pour faire une incision le long du sternum de l’embryon s’étendant entre les clavicules jusqu’au nombril. Faire des incisions très fines et superficielles tout en travaillant progressivement vers l’intérieur de la cavité thoracique, ouvrir l’abdomen de l’embryon.
Lorsque le cœur devient visible, utilisez une paire de forceps pour presser le torse légèrement dorloté à la cage thoracique pour peler les côtes ouvertes. À l’aide des côtés d’une paire de forceps, saisir délicatement les vaisseaux sanguins pulmonaires sans séparer le tissu et sortir le cœur de la cavité. Nettoyez le cœur en PBS-EDTA frais pendant une à deux minutes avant de fixer le tissu en 4%Paraformaldéhyde pendant 45 à 60 minutes.
Ensuite, laver le cœur trois fois pendant 5 à 10 minutes par lavage en PBS complété par de la glycine. Avant de stocker les cœurs en PBS à quatre degrés Celsius. Pour préparer le cœur à la cryosection, placez les échantillons dans un tube de 30% saccharose et PBS à quatre degrés Celsius pendant 24 à 40 heures.
Lorsque les cœurs ont coulé au fond du tube, utilisez une pipette Pasteur avec une pointe modifiée pour transférer soigneusement chaque cœur à un morceau d’essuie-glace sans peluche. Après un bref séchage à l’air, placez chaque échantillon dans des moules de température de coupe optimaux individuels dans les orientations souhaitées pour la section. Submergez les tissus dans un milieu de température de coupe optimal sans bulles.
Ensuite, conservez les moules à 20 degrés Celsius jusqu’à quelques jours avant de congeler les tissus à 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures avant la cryosection. Pour obtenir des sections cryostat des échantillons, utilisez un milieu de coupe de température optimal frais pour fixer le bloc d’intérêt tissulaire au mandrin du cryostat et permettre au milieu de geler jusqu’à ce qu’il soit blanc opaque. Insérez une nouvelle lame et ajustez la distance entre le bloc tissulaire et la lame pour permettre d’obtenir des sections.
Couper le bloc en tranches de 10 micromètres jusqu’à ce que le point d’intérêt soit atteint. Lorsque le tissu peut être observé, utilisez un petit pinceau plat pour tirer doucement la tranche contre le support dans un mouvement continu de coupe. Une fois que le tissu a été complètement coupé à travers, utilisez la brosse de détail pour tapoter la tranche à plat contre la scène.
Maintenez la section en place pendant environ 20 à 30 secondes avant d’enlever la brosse détaillée et de terminer la tranche. Utilisez les deux pinceaux pour aplatir doucement la tranche contre la scène empêchant tout roulement et maintenez la section tissulaire contre la scène. Après 20 à 30 secondes, retournez la section et aplatissez-la à nouveau contre la scène avant de placer une glissière chargée électrostatiquement suffisamment près pour que la tranche soit attirée et adhèrez à la glissade sans avoir à toucher la glissade jusqu’à la scène.
Pour évaluer les sections des tissus cardiaques pour la présence de malformations cardiaques courantes, à l’aide d’un microscope équipé d’une caméra, obtenir des images à 5 à 10X et 40X grossissements. Pour l’analyse du compactage musculaire cardiaque, ouvrez un tissu d’intérêt dans un logiciel approprié d’analyse d’image et réglez l’image en 8 bits. Pour définir le seuil de l’image, cliquez sur Image, Ajustez et Seuilz et déplacez la barre supérieure pour ajuster le seuil jusqu’à ce que seuls les pixels de l’arrière-plan soient sélectionnés.
Ensuite, utilisez l’outil de sélection des polygones pour dessiner une région d’intérêt autour du tissu, puis cliquez sur Analyser, définir les mesures, la zone et limiter au seuil. Cliquez sur Analyser et mesurer pour mesurer la zone des pixels surligné pour obtenir la valeur de la zone de l’espace négatif. Pour mesurer la zone de toute la région d’intérêt, cliquez sur Analyser, définir les mesures et désélectionner la limite au seuil.
Ensuite, sélectionnez Analyser et mesurer pour mesurer l’ensemble de la zone d’intérêt sélectionnée. Pour calculer la zone du tissu musculaire, soustrayez la zone de l’espace négatif de la zone de la région d’intérêt. Ensuite, diviser la zone du tissu musculaire par la zone de la région d’intérêt pour calculer le compactage musculaire et X.The coloration des tranches de tissu à partir de cœurs embryonnaires récoltés, fournit suffisamment de contraste pour faire les bords des tissus, mais n’est pas si sombre que de rendre les caractéristiques cellulaires indiscernables.
Dans cette analyse représentative, le compactage musculaire a été observé pour être sensiblement réduit dans les coeurs expérimentaux par rapport aux embryons qui se sont développés dans des conditions non expérimentales. Ces échantillons sont précieux et nécessitent beaucoup de temps pour créer. Pendant les autopsies et la section cryostat en particulier, assurez-vous d’être intentionnel sur chaque action que vous effectuez.
La préservation des tissus en paraformaldéhyde maintient l’activité antigène permettant aux échantillons d’être utilisés pour des tests comme la coloration d’aminofluorescéine qui aident à identifier les causes pathologiques trouvées au cours de l’évaluation morphologique. Dans notre laboratoire, nous avons obtenu une représentation quantitative des traitements expérimentaux qui peut nous aider à identifier dans quelle mesure différents traitements affectent nos échantillons. Le paraformaldéhyde peut fixer n’importe quel tissu qu’il touche.
Prenez soin de toujours porter des gants pour minimiser la peau exposée et de travailler dans une hotte de film chaque fois que vous travaillez avec ce produit chimique.
