Dieses Protokoll standardisiert neue Gewebeanalysetechniken, so dass sie von anderen Gruppen, die auch angeborene Herzfehler untersuchen, weiter verbreitet werden können. Da sowohl qualitative als auch quantitative Analysetechniken ihre Vor- und Nachteile haben, verwendet diese Methode sowohl die breiteste Palette experimenteller Fragen. Diese Techniken können sich positiv auf die kardiologischen Diagnosemethoden auswirken.
Beispielsweise könnten Pathologen unsere mikroskopischen Herzgewebeanalysetechniken anwenden, um menschliche Herzkrankheiten aus Biopsieproben zu diagnossieren. Dieses Protokoll kann für die Entwicklungskardiologie oder die allgemeine Kardiologieforschung verwendet werden. Diese Methoden bieten jedoch auch verschiedene nützliche Techniken, die auf jede Gewebeanalyse angewendet werden können.
Um den embryonalen Tag 15 bis 15,5 Herzen zu sammeln, sichern Sie die Gliedmaßen einer trächtigen Mutter und beginnen Sie um die Harnröhre bis zum Brustbein, machen Sie vorsichtig einen I-förmigen Schnitt entlang des Oberkörpers. Mit Zangen in einer Schaufelbewegung, heben Sie sanft die Gebärmutter aus der Bauchhöhle greifen die oberflächlichen Gewebe der Gebärmutter nach Bedarf mit feinen Zangen bei der Extraktion zu helfen. Verwenden Sie eine Schere, um die Gebärmutter aus dem Bauch zu lösen.
Nachdem Sie die Gebärmutter in eiskaltes PBS eintränkt haben, heften Sie das Organ in eine Sezierschale. Schneiden Sie die Gebärmutter mit einer Schere in einzelne Abschnitte, die jeweils einen separaten Embryo enthalten. Mit zwei Paaren feiner Zangen schälen Sie die Embryonen vorsichtig aus dem Gebärmuttergewebe und legen Sie sie in eine neue Petrischale mit vier Grad Celsius PBS-EDTA.
Um die Herzen zu sammeln, legen Sie die Schale unter ein Sezieren Mikroskop und verwenden Sie zwei Paare von feinen Zangen, um den Embryo in die Supine-Position zu positionieren. Nach der Stabilisierung des Zugangs zur Brust, verwenden Sie den scharfen Punkt eines zweiten Paar feine Zange, um einen Schnitt entlang des Brustbeins des Embryos, der zwischen den Schlüsseln bis zum Nabel erstreckt. Machen sehr feine und oberflächliche Schnitte, während nach und nach in Richtung der Innenseite der Brusthöhle arbeiten, öffnen Sie den Bauch des Embryos.
Wenn das Herz gerade sichtbar wird, verwenden Sie ein Paar Zange, um den Oberkörper leicht in den Rippenkäfig zu drücken, um die Rippen zu schälen. Greifen Sie mit den Seiten eines Zangenpaares die Lungenblutgefäße sanft, ohne das Gewebe zu trennen, und ziehen Sie das Herz aus der Höhle. Reinigen Sie das Herz in frischem PBS-EDTA für ein bis zwei Minuten, bevor Sie das Gewebe in 4%Paraformaldehyd für 45 bis 60 Minuten fixieren.
Dann waschen Sie das Herz dreimal für 5 bis 10 Minuten pro Wäsche in PBS mit Glycin ergänzt. Vor der Lagerung der Herzen in PBS bei vier Grad Celsius. Um das Herz auf die Kryosektion vorzubereiten, legen Sie die Proben 24 bis 40 Stunden lang in eine Röhre mit 30% Saccharose und PBS bei vier Grad Celsius.
Wenn die Herzen auf den Boden der Röhre gesunken sind, verwenden Sie eine Pasteur Pipette mit einer modifizierten Spitze, um jedes Herz vorsichtig auf ein Stück fusselfreies Wischen zu übertragen. Nach einer kurzen Lufttrocknung jede Probe in individuelle optimale Schnitttemperaturformen in den gewünschten Ausrichtungen für das Schneiden aufstellen. Tauchen Sie das Gewebe in ein optimales Schnitttemperaturmedium ohne Blasen.
Dann lagern Sie die Formen bei 20 Grad Celsius für bis zu ein paar Tage, bevor Sie das Gewebe bei 80 Grad Celsius für mindestens 24 Stunden einfrieren, bevor Sie kryosectioning. Um Kryostatabschnitte der Proben zu erhalten, verwenden Sie frische optimale Temperaturschneidmedium, um den Gewebeblock von Interesse an das Futter des Kryostats zu befestigen und lassen Sie das Medium einfrieren, bis es undurchsichtig weiß ist. Setzen Sie eine neue Klinge ein, und passen Sie den Abstand zwischen dem Gewebeblock und der Klinge an, damit Abschnitte erhalten werden können.
Schneiden Sie den Block in 10 Mikrometer-Scheiben, bis der Point of Interest erreicht ist. Wenn das Gewebe beobachtet werden kann, verwenden Sie einen kleinen flachen Pinsel, um die Scheibe vorsichtig gegen den Ständer in einer kontinuierlichen Schnittbewegung zu ziehen. Sobald das Gewebe vollständig durchgeschnitten wurde, verwenden Sie die Detailbürste, um die Scheibe flach gegen die Bühne zu klopfen.
Halten Sie den Abschnitt ca. 20 bis 30 Sekunden an Ort und Stelle, bevor Sie den detaillierten Pinsel entfernen und die Scheibe fertigstellen. Verwenden Sie beide Pinsel, um die Scheibe sanft gegen die Bühne abzuflachen und das Rollen zu verhindern und halten Sie den Gewebeabschnitt gegen die Bühne. Nach 20 bis 30 Sekunden den Abschnitt umdrehen und wieder gegen die Bühne abflachen, bevor Sie eine elektrostatisch geladene Rutsche so nah stellen, dass die Scheibe angezogen und an der Folie haften kann, ohne die Folie auf die Bühne berühren zu müssen.
Um die Herzgewebeabschnitte auf das Vorhandensein von häufigen Herzfehlern zu bewerten, erhalten Sie mit einem Mikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist, Bilder mit 5- bis 10-facher und 40-facher Vergrößerung. Für die Herzmuskelverdichtungsanalyse öffnen Sie ein Gewebe von Interesse in einem geeigneten Bildanalyse-Softwareprogramm und stellen Sie das Bild auf 8-Bit ein. Um den Schwellenwert des Bildes festzulegen, klicken Sie auf Bild, Anpassen und Schwellenwert, und verschieben Sie die obere Leiste, um den Schwellenwert anzupassen, bis nur die Pixel für den Hintergrund ausgewählt sind.
Verwenden Sie als Nächstes das Polygonauswahlwerkzeug, um einen Bereich von Interesse um das Gewebe zu zeichnen, und klicken Sie dann auf Analysieren, Messen festlegen, Fläche und Grenzwert auf Schwellenwert begrenzen. Klicken Sie auf Analysieren und Messen, um den Bereich der hervorgehobenen Pixel zu messen, um den Wert der Fläche des negativen Raums zu erhalten. Um den Bereich der gesamten Interessensregion zu messen, klicken Sie auf Analysieren, Festlegen von Messungen und deaktivieren Sie limit to threshold.
Wählen Sie dann Analysieren und Messen aus, um den gesamten Bereich der ausgewählten Interessenregion zu messen. Um den Bereich des Muskelgewebes zu berechnen, subtrahieren Sie den Bereich des negativen Raums vom Bereich der Interessenregion. Dann teilen Sie den Bereich des Muskelgewebes durch den Bereich der Region des Interesses, um die Muskelverdichtung und X zu berechnen. Die Färbung von Gewebescheiben aus geernteten embryonalen Herzen, bietet genügend Kontrast, um die Geweberänder zu machen, ist aber nicht so dunkel, dass die Zellmerkmale ununterscheidbar zu machen.
In dieser repräsentativen Analyse wurde beobachtet, dass die Muskelverdichtung in den versuchsreichen Herzen im Vergleich zu den Embryonen, die sich unter nicht experimentellen Bedingungen entwickelten, signifikant reduziert wurde. Diese Beispiele sind wertvoll und erfordern eine lange Zeit zu erstellen. Während Der Nekropsien und der Kryostat-Sektion speziell, stellen Sie sicher, dass absichtlich über jede Aktion, die Sie durchführen.
Die Erhaltung der Gewebe in Paraformaldehyd hält die Antigenaktivität aufrecht, die es ermöglicht, die Proben für Tests wie Aminofluorescein-Färbung zu verwenden, die helfen, pathologische Ursachen zu identifizieren, die während der Morphologiebewertung gefunden wurden. In unserem Labor haben wir eine quantitative Darstellung experimenteller Behandlungen erhalten, die uns helfen können, das Ausmaß zu identifizieren, in dem verschiedene Behandlungen unsere Proben beeinflussen. Paraformaldehyd kann jedes Gewebe reparieren, das es berührt.
Achten Sie darauf, immer Handschuhe zu tragen, um die exponierte Haut zu minimieren und in einer Filmhaube zu arbeiten, wenn Sie mit dieser Chemikalie arbeiten.
