Este protocolo padroniza novas técnicas de análise de tecidos para que possam ser mais amplamente utilizadas por outros grupos que também estudam defeitos cardíacos congênitos. Como tanto as técnicas de análise qualitativa quanto quantitativa têm seus prós e contras, essa metodologia utiliza tanto para abordar a mais ampla gama de questões experimentais. Essas técnicas podem ter um impacto positivo nos métodos de diagnóstico de cardiologia.
Por exemplo, os patologistas poderiam aplicar nossas técnicas de análise de tecido cardíaco microscópico para diagnosticar doenças cardíacas humanas a partir de amostras de biópsia. Este protocolo pode ser usado para pesquisa de cardiologia de desenvolvimento ou cardiologia geral. No entanto, esses métodos também fornecem várias técnicas úteis que podem ser aplicadas para qualquer análise tecidual.
Para coletar corações embrionários de 15 a 15,5 corações, fixar os membros de uma represa grávida e começar ao redor da uretra até o esterno, cuidadosamente fazer uma incisão em forma de I ao longo do tronco. Usando fórceps em um movimento de colher, levante suavemente o útero da cavidade abdominal segurando os tecidos superficiais do útero conforme necessário com fórceps finos para ajudar na extração. Use uma tesoura para soltar o útero do abdômen.
Depois de absorver o útero em PBS gelado, fixe o órgão em um prato de dissecção. Usando uma tesoura, corte o útero em seções individuais, cada uma contendo um embrião separado. Usando dois pares de fórceps finos, retire suavemente os embriões do tecido uterino e coloque-os em uma nova placa de Petri contendo quatro graus Celsius PBS-EDTA.
Para coletar os corações, coloque o prato sob um microscópio dissecando e use dois pares de fórceps finos para posicionar o embrião na posição supina. Após estabilizar o acesso ao peito, use o ponto afiado de um segundo par de fórceps finos para fazer uma incisão ao longo do esterno do embrião estendendo-se entre as clavículas até o umbigo. Fazer incisões muito finas e superficiais enquanto trabalha gradualmente em direção ao interior da cavidade torácica, abra o abdômen do embrião.
Quando o coração se tornar visível, use um par de fórceps para espremer o tronco ligeiramente preso à caixa torácica para descascar as costelas abertas. Usando as laterais de um par de fórceps, pegue suavemente os vasos sanguíneos pulmonares sem separar o tecido e puxe o coração para fora da cavidade. Limpe o coração em PBS-EDTA fresco por um a dois minutos antes de fixar o tecido em 4% Paraformaldeído por 45 a 60 minutos.
Em seguida, lave o coração três vezes por 5 a 10 minutos por lavagem em PBS complementado com glicina. Antes de armazenar os corações na PBS a quatro graus Celsius. Para preparar o coração para a crioseção, coloque as amostras em um tubo de 30% de sacarose e PBS a quatro graus Celsius por 24 a 40 horas.
Quando os corações tiverem afundado na parte inferior do tubo, use uma Pasta de Pipeta com uma ponta modificada para transferir cuidadosamente cada coração para um pedaço de lenço livre de fiapos. Após uma breve secagem do ar, coloque cada amostra em moldes de temperatura de corte ideais individuais nas orientações desejadas para secção. Submergir os tecidos em meio de temperatura de corte ideal sem bolhas.
Em seguida, armazene os moldes a 20 graus Celsius por até alguns dias antes de congelar os tecidos a 80 graus Celsius por pelo menos 24 horas antes de criosectioning. Para obter seções criostatas das amostras, use um meio de corte de temperatura ideal fresco para anexar o bloco de tecido de interesse ao mandril do criostat e permitir que o meio congele até que seja branco opaco. Insira uma nova lâmina e ajuste a distância entre o bloco tecidual e a lâmina para permitir que seções sejam obtidas.
Corte o bloco em fatias de 10 micrômetros até que o ponto de interesse seja atingido. Quando o tecido puder ser observado, use um pequeno pincel plano para puxar suavemente a fatia contra o suporte em um movimento de corte contínuo. Uma vez que o tecido tenha sido completamente cortado, use a escova de detalhes para acariciar a fatia plana contra o palco.
Mantenha a seção no lugar por aproximadamente 20 a 30 segundos antes de remover o pincel detalhado e terminar a fatia. Use ambas as pincéis para achatar suavemente a fatia contra o palco impedindo qualquer rolamento e segure a seção do tecido contra o palco. Após 20 a 30 segundos, gire a seção e achate-a contra o palco novamente antes de colocar um slide eletroessalticamente carregado perto o suficiente para que a fatia seja atraída e adere ao slide sem ter que tocar o slide para o palco.
Para avaliar as seções do tecido cardíaco para a presença de defeitos cardíacos comuns, utilizando um microscópio equipado com uma câmera, obtenha imagens a 5 a 10X e ampliações de 40X. Para análise de compactação muscular cardíaca, abra um tecido de interesse em um programa de análise de imagem apropriado e defina a imagem para 8 bits. Para definir o limiar da imagem, clique em Imagem, Ajuste e Limiar e mova a barra superior para ajustar o limiar até que apenas os pixels para o plano de fundo sejam selecionados.
Em seguida, use a ferramenta de seleções de polígonos para desenhar uma região de interesse em torno do tecido e, em seguida, clique em Analisar, Definir Medidas, Área e Limite ao limiar. Clique em Analisar e Medir para medir a área dos pixels destacados para obter o valor da área do espaço negativo. Para medir a área de toda a região de interesse, clique em Analisar, Definir Medidas e desmarcar Limite para limite.
Em seguida, selecione Analisar e Medir para medir toda a área da região selecionada de interesse. Para calcular a Área de tecido muscular, subtraia a Área de Espaço Negativo da Área da Região de Interesse. Em seguida, divida a Área do Tecido Muscular pela Área da Região de Interesse para calcular a compactação muscular e X.A coloração de fatias de tecido de corações embrionários colhidos, proporciona contraste suficiente para ver as bordas teciduais, mas não é tão escura a ponto de tornar as características celulares indistinguíveis.
Nesta análise representativa, observou-se que a compactação muscular foi significativamente reduzida nos corações experimentais em relação aos embriões desenvolvidos em condições não experimentais. Essas amostras são valiosas e requerem muito tempo para serem criadas. Durante a necropsia e a seção criostate especificamente, certifique-se de ser intencional sobre cada ação que você executar.
A preservação dos tecidos em Paraformaldeído mantém a atividade de antígeno permitindo que as amostras sejam usadas para testes como a coloração de Aminofluoresceína que ajudam a identificar causas patológicas encontradas durante a avaliação da morfologia. Em nosso laboratório, obtivemos representação quantitativa de tratamentos experimentais que podem nos ajudar a identificar até que ponto diferentes tratamentos afetam nossas amostras. Paraformaldeído pode consertar qualquer tecido que toque.
Tome cuidado para sempre usar luvas para minimizar a pele exposta e trabalhar em um capuz de filme sempre que trabalhar com este produto químico.
