Ce projet a été financé par le KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma et High-grade Glioma). Nous remercions Ilya Skachkov et Charles Mougenot pour leur contribution au développement du système.

Toutes les expériences in vivo ont été approuvées par le comité d’éthique néerlandais (numéro de permis avd114002017841) et l’organisme de protection des animaux de la Vrije Universiteit Amsterdam, aux Pays-Bas. Les enquêteurs ont été formés aux bases du système FUS afin de minimiser l’inconfort des animaux.
1. Système d’ultrasons focalisés
REMARQUE: La configuration décrite est un système de perturbation BBB construit en interne basé sur des composants disponibles dans le commerce et comprend un cône sur mesure imprimé en 3D et une plate-forme stéréotaxique détachable. Le système est conçu modulaire, ce qui facilite les modifications en fonction de l’équipement disponible et de l’utilisation spécifique. Le protocole décrit la procédure pour la sonoporation d’une plus grande zone dans la région pontine du cerveau de souris. En ajustant l’emplacement de la cible, différentes parties du cerveau pourraient être ciblées. Dans cette étude, un transducteur mono-élément de 1 MHz avec une distance focale de 75 mm, une ouverture de 60 mm et une zone focale de 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM de pression de crête) a été utilisé. Le plan focal du transducteur est positionné à travers le crâne de l’animal dans le plan horizontal se croisant avec les barres d’oreille.
<ol><li>Sélectionnez un transducteur approprié pour l’ouverture de la BHE chez les rongeurs. NOTE: Sur la base des propriétés des microbulles et de la fréquence employée, les réglages acoustiques, en particulier l’indice mécanique (MI), sont sujets à changement13,38.</li>
	<li>Placez le transducteur dans le cône imprimé en 3D.</li>
	<li>Utilisez une membrane mylar acoustiquement transparente à l’extrémité inférieure du cône pour obtenir un couplage acoustique du chemin de propagation du faisceau et remplissez le cône d’eau dégazée.</li>
	<li>Monter le transducteur au-dessus de l’animal sur un étage linéaire motorisé comme le montre la figure 1 permettant un positionnement vertical automatique du transducteur.</li>
	<li>Concevoir une plate-forme stéréotaxique détachable basée sur les exigences de l’étude, qui comprend le chauffage à température régulée, les barres de morsure et d’oreille, l’anesthésie et les marqueurs fiduciaux multimodaux, comme le montrent les figures 1 et 2. Le montage de la plate-forme stéréotaxique consiste en un système de scène linéaire 2D, qui permet un positionnement automatique précis (< 0,1 mm) de l’animal sous le faisceau.</li>
	<li>Connectez le transducteur à la chaîne d’émission acoustique représentée sur la figure 1 constituée d’un transducteur, d’un générateur de fonctions et d’un amplificateur de puissance.</li>
	<li>Concevoir un pipeline de traitement d’image pour détecter les marqueurs fiduciaux multi-modalité qui permet un ciblage précis de sonoporation de la zone d’intérêt du cerveau et la collecte des données de cavitation détectées par l’hydrophone de l’aiguille.</li>
	<li>Calibrer le système et déterminer le point de focalisation du transducteur en correspondance avec le positionnement vertical de l’animal sur la plate-forme stéréotaxique.</li>
</ol>2. Préparation des animaux
REMARQUE: Le protocole suivant est spécifié pour les souris, mais peut être adapté pour les rats. Pour ces expériences femelles athymiques nues Foxn1-/- souris (6-8 semaines) ont été utilisés.
<ol><li>Permettre à l’animal de s’acclimater pendant au moins une semaine dans l’installation pour animaux et peser l’animal régulièrement.</li>
	<li>Administrer de la buprénorphine (0,05 mg/kg) par injection sous-cutanée (s.c.) 30 min avant le traitement FUS pour commencer le traitement analgésique.</li>
	<li>Anesthésier l’animal avec 3% d’isoflurane, 2 L/minO2 et vérifier que l’animal est profondément anesthésié. Gardez les animaux anesthésiés pendant toute la procédure et surveillez la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque pour ajuster la concentration d’isoflurane au besoin.</li>
	<li>Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse oculaire et éviter d’éventuelles blessures.</li>
	<li>Retirez les cheveux sur le dessus de la tête avec un rasoir et une crème dépilatoire et lavez ensuite à l’eau pour éliminer les résidus afin d’éviter toute irritation de la peau.</li>
	<li>Pour les expériences avec des modèles de tumeurs BLI, injecter 150 μL de D-luciférine (30 mg/mL) intrapéritonéale (i.p.) avec une seringue à insuline de 29 G pour le guidage de l’image BLI.</li>
	<li>Insérez un cathéter de veine caudale de 26 à 30 G et rincez le cathéter et la veine avec un petit volume de solution d’héparine (5 UI/mL). Remplissez le cathéter avec une solution d’héparine pour éviter la coagulation du sang. REMARQUE: Un bon cathétérisme est observé lorsqu’il y a un reflux de sang dans le cathéter. Évitez les bulles d’air dans le cathéter pour prévenir les embolies. Pour éviter une pression d’injection excessive, assurez-vous que la longueur du cathéter est aussi courte que possible.</li>
	<li>Placez l’animal sur la plate-forme stéréotaxique à température réglée pour éviter l’hypothermie. REMARQUE: L’hypothermie réduit la circulation sanguine, ce qui peut affecter l’injection / circulation des microbulles et la pharmacocinétique des médicaments39.</li>
	<li>Immobilisez et fixez la tête de l’animal sur la plate-forme stéréotaxique à l’aide de barres d’oreille et d’une barre de morsure. Fixez le corps avec une sangle et collez la queue de l’animal sur la plate-forme.</li>
</ol>3. Ultrasons focalisés guidés par l’image in vivo
REMARQUE: Pour ce protocole, un transducteur mono-élément de 1 MHz avec une impulsion de rafale de tonalité avec une durée de 10 ms, un MI de 0,4 et une fréquence de répétition d’impulsion de 1,6 Hz avec 40 cycles pendant 240 s a été utilisé. Le protocole est optimisé pour les microbulles stabilisées par des phospholipides contenant de l’hexafluorure de soufre(SF6)comme gaz inoffensif, dont le diamètre moyen des bulles est de 2,5 μm et plus de 90% des bulles sont inférieures à 8 μm.
<ol><li>Placez la plate-forme stéréotaxique avec l’animal monté dans la modalité d’imagerie (p. ex. BLI ou rayons X) et prenez la ou les images de l’animal.</li>
	<li>Utilisez les marqueurs fiduciaux multimodaux en combinaison avec le pipeline de traitement d’image pour marquer la position de l’animal en fonction du point de focalisation du transducteur.</li>
	<li>Déterminer la zone cible en plaçant un contour du cerveau sur l’image radiographique acquise ou en utilisant des images BLI pour déterminer le centre de la tumeur(Figure 2). La position de parties spécifiques du cerveau est spécifiée dans l’Atlas cérébral Paxinos40 en utilisant les marques du crâne bregma et lambda comme points de référence. Par exemple, le pont est situé x=-1.0, y=-0.8 et z=-4.5 de lambda.</li>
	<li>Protégez les narines et la bouche de l’animal avec du ruban adhésif pour éviter que le gel à ultrasons n’interfère avec la respiration.</li>
	<li>Appliquez du gel à ultrasons sur le dessus de la tête de l’animal.</li>
	<li>Rétractez la peau du cou des animaux, lubrifiez l’hydrophone de l’aiguille avec du gel à ultrasons et placez l’hydrophone de l’aiguille à proximité directe de l’os occipital.</li>
	<li>Guidez le transducteur à la bonne position à l’aide du pipeline de traitement d’image et du point de mise au point.</li>
	<li>Appliquez les paramètres préconfigurés à tous les périphériques connectés et ciblez la région du cerveau qui vous intéresse. REMARQUE: Selon la question de recherche, les régions tumorales ou cérébrales peuvent être sonoporated comme un point focal unique ou comme forme volumétrique, comme le montre la figure 2.</li>
	<li>Activer les microbulles comme décrit par le fabricant. Injecter un bolus de 120 μL (5,4 μg) de microbulles.</li>
	<li>Rincer le cathéter de la veine caudale avec une solution saline pour vérifier l’ouverture du cathéter.</li>
	<li>Injectez les microbulles et commencez l’insonation.</li>
	<li>Enregistrer la cavitation de microbulles avec l’hydrophone à aiguille.</li>
	<li>Administrer un agent de contraste intravasculaire ou un médicament après sonoporation. La dose, le moment et la planification dépendent de l’objectif de l’étude et du médicament. REMARQUE: Evans bleu est un agent de couleur commun pour évaluer l’ouverture BBB41.</li>
	<li>Surveiller l’animal jusqu’au point de temps prédéterminé ou avant le paramètre sans cruauté.</li>
</ol>4. Analyse de la cavitation des microbulles
REMARQUE: Ici, la procédure appliquée est décrite, quiconvient à l’expérimentation in vivo pour les microbulles de SF 6-phospholipides d’un diamètre moyen de 2,5 μm (80% des bulles inférieures à 8 μm) excitées avec une impulsion de rafale de 10 ms à une fréquence de 1 MHz, comme suggéré à l’origine par McDannold et al.12.
<ol><li>Fourier-transformer le signal PCD enregistré du domaine temporel dans le domaine fréquentiel.</li>
	<li>Intégrer la puissance spectrale résultante pour une détection de cavitation stable autour de la 2ème et3ème harmonique (± 50 kHz), comme le montre la figure 3 (boîte verte à 2 et 3 MHz).</li>
	<li>Intégrer la puissance spectrale pour la détection de cavitation inertielle, entre la fréquence principale, la 2ème,la3ème harmonique, la 1ème et 2ème ultraharmonique et la première sous-harmonique (± 150 kHz), comme le montre la figure 3 (boîtes rouges).</li>
	<li>Intégrer la puissance spectrale autour de la fréquence principale (1 MHz ± 50 kHz) pour la normalisation des deux signaux PCD précédemment obtenus. REMARQUE: Le signal PCD, pour les microbulles SF6-phospholipidesin vivo à 1 MHz, n’affiche pas d’ultraharmonie ou de sous-harmonie avant que la cavitation inertielle ne s’installe, comme le montre la figure 3.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cette étude, nous avons développé un système FUS basé sur une image guidée rentable pour la perturbation transitoire de la BHE pour une administration accrue de médicaments dans le parenchyme cérébral. Le système a été en grande partie construit avec des composants disponibles dans le commerce et en conjonction avec les rayons X et BLI. La modularité de la conception proposée permet l’utilisation de plusieurs modalités d’imagerie pour la planification et l’évaluation dans les flux de travail à...

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est un obstacle majeur à l’administration de médicaments dans le parenchyme cérébral. La plupart des médicaments thérapeutiques qui ont été développés ne franchissent pas la BHE en raison de leurs paramètres physico-chimiques (par exemple, lipphilie, poids moléculaire, accepteurs de liaison hydrogène et donneurs) ou ne sont pas conservés en raison de leur affinité pour les transporteurs d’efflux dans le cerveau1,2. Le petit groupe de médicaments qui peuvent traverser la BHE sont généralement de petites molécules lipophiles, qui ne sont efficaces que dans un nombre limité de maladies du cerveau1,2. En conséquence, pour la majorité des maladies du cerveau, les options de traitement pharmacologique sont limitées et de nouvelles stratégies d’administration de médicaments sont nécessaires3,4.
L’échographie thérapeutique est une technique émergente qui peut être utilisée pour différentes applications neurologiques telles que la perturbation de la BHE (BBBD), la neuromodulation et l’ablation4,5,6,7. Afin d’obtenir une ouverture BBB avec un émetteur ultrasonoreal extracorporeal à travers le crâne, ultrasons focalisés (FUS) est combiné avec des microbulles. Fus microbulles-négociés entraîne une biodisponibilité accrue des médicaments dans le parenchyme cérébral5,8,9. En présence d’ondes sonores, les microbulles commencent à osciller en initiant la transcytose et la perturbation des jonctions serrées entre les cellules endothéliales de la BHE, permettant le transport paracellulaire de molécules plus grosses10. Des études antérieures ont confirmé la corrélation entre l’intensité de l’émission acoustique et l’impact biologique sur l’ouverture BBB11,12,13,14. FUS en association avec des microbulles a déjà été utilisé dans des essais cliniques pour le traitement du glioblastome en utilisant le témozolomide ou la doxorubicine liposomale comme agent chimiothérapeutique, ou pour le traitement de la maladie d’Alzheimer et de la sclérose latérale amyotrophique5,9,15,16.
Puisque l’ouverture de BBB négociée par ultrasons a comme conséquence des possibilités entièrement nouvelles pour la pharmacothérapie, la recherche préclinique pour l’application clinique est nécessaire pour évaluer la réponse de thérapie des candidats médicamenteux sélectionnés. Cela nécessite généralement un flux de travail à haut débit avec une précision spatiale élevée et de préférence une détection de cavitation intégrée pour la surveillance de l’ouverture BHE ciblée avec une reproductibilité élevée. Si possible, ces systèmes doivent être rentables en termes d’investissement initial et de coûts d’exploitation afin d’être évolutifs en fonction de la taille de l’étude. La plupart des systèmes FUS précliniques sont combinés avec l’IRM pour le guidage d’image et la planification du traitement15,17,18,19. Bien que l’IRM donne des informations détaillées sur l’anatomie et le volume de la tumeur, il s’agit d’une technique coûteuse, qui est généralement effectuée par des opérateurs formés / qualifiés. De plus, l’IRM à haute résolution n’est pas toujours disponible pour les chercheurs dans les installations précliniques et nécessite de longs temps de balayage par animal, ce qui la rend moins adaptée aux études pharmacologiques à haut débit. Il convient de noter que, pour la recherche préclinique dans le domaine de la neuro-oncologie, en particulier les modèles tumoraux infiltrants, la possibilité de visualiser et de cibler la tumeur est essentielle pour la réussite du traitement20. Actuellement, cette exigence n’est remplie que par IRM ou par des tumeurs transduites avec une photoprotéine, permettant la visualisation avec imagerie par bioluminescence (BLI) en combinaison avec l’administration du substrat photoprotéique.
Les systèmes FUS guidés par IRM utilisent souvent un bain-marie pour assurer la propagation des ondes ultrasonores pour les applications transcrâniennes, par lequel la tête de l’animal est partiellement immergée dans l’eau, les systèmes dits « ascendants »15,17,18. Bien que ces conceptions fonctionnent généralement bien dans les études sur les petits animaux, elles constituent un compromis entre les temps de préparation des animaux, la portabilité et les normes d’hygiène réalistes et maintenables pendant l’utilisation. Comme alternative à l’IRM, d’autres méthodes de guidage pour la navigation stéréotaxique englobent l’utilisation d’un atlas anatomique de rongeur21,22, 23,d’une observation visuelle assistée par pointeur laser24,d’un dispositif de balayage mécanique assisté par sténopé25,ou D’un BLI26. La plupart de ces conceptions sont des systèmes « top-down » dans lesquels le transducteur est placé sur le dessus de la tête de l’animal, avec l’animal dans une position naturelle. Le flux de travail « descendant » consiste soit en un bain-marie22,25,26, soit en un cône rempli d’eau21,24. L’avantage d’utiliser un transducteur à l’intérieur d’un cône fermé est l’encombrement plus compact, le temps de configuration plus court et les possibilités de décontamination simples simplifiant l’ensemble du flux de travail.
L’interaction du champ acoustique avec les microbulles dépend de la pression et va des oscillations de faible amplitude (appelées cavitation stable) à l’effondrement transitoire des bulles (appelé cavitation inertielle)27,28. Il existe un consensus établi selon lequel l’échographie-BBBD nécessite une pression acoustique bien supérieure au seuil de cavitation stable pour obtenir une BBBD réussie, mais inférieure au seuil de cavitation inertielle, qui est généralement associé à des dommages vasculaires / neuronaux29. La forme la plus courante de surveillance et de contrôle est l’analyse du signal acoustique (rétro-)dispersé à l’aide de la détection de cavitation passive (PCD), comme le suggèrent McDannold et al.12. PCD s’appuie sur l’analyse des spectres de Fourier des signaux d’émission de microbulles, dans lesquels la force et l’apparence des caractéristiques de cavitation stables (harmoniques, sous-harmoniques et ultraharmoniques) et des marqueurs de cavitation inertielle (réponse à large bande) peuvent être mesurées en temps réel.
Une analyse PCD « taille unique » pour un contrôle précis de la pression est compliquée en raison de la polydispersité de la formulation de microbulles (l’amplitude d’oscillation dépend fortement du diamètre de la bulle), des différences dans les propriétés de la coque de la bulle entre les marques et de l’oscillation acoustique, qui dépend fortement de la fréquence et de la pression30,31,32. En conséquence, de nombreux protocoles de détection pcd différents ont été suggérés, qui ont été adaptés à des combinaisons particulières de tous ces paramètres et ont été utilisés dans divers scénarios d’application (allant de l’expérimentation in vitro sur des protocoles de petits animaux à PCD pour un usage clinique) pour la détection de cavitation robuste et même pour le contrôle rétroactif de rétroaction de la pression11,14,30, 31,32,33,34,35. Le protocole PCD utilisé dans la portée de cette étude est dérivé directement de McDannold et al.12 et surveille l’émission harmonique pour la présence d’une cavitation stable et d’un bruit à large bande pour la détection de la cavitation inertielle.
Nous avons développé un système FUS de neuronavigation guidé par l’image pour l’ouverture transitoire de la BHE afin d’augmenter l’administration de médicaments dans le parenchyme cérébral. Le système est basé sur des composants disponibles dans le commerce et peut être facilement adapté à plusieurs modalités d’imagerie différentes, en fonction des techniques d’imagerie disponibles dans l’installation pour animaux. Étant donné que nous avons besoin d’un flux de travail à haut débit, nous avons choisi d’utiliser les rayons X et le BLI pour le guidage d’image et la planification du traitement. Les cellules tumorales transduites avec une photoprotéine (par exemple, luciférase) conviennent à l’imagerie BLI20. Après l’administration du substrat photoprotéique, les cellules tumorales peuvent être surveillées in vivo et la croissance et l’emplacement de la tumeur peuvent êtredéterminés 20,36. BLI est une modalité d’imagerie à faible coût, il permet de suivre la croissance tumorale au fil du temps, il a des temps de balayage rapides et il est bien corrélé avec la croissance tumorale mesurée par IRM36,37. Nous avons choisi de remplacer le bain-marie par un cône rempli d’eau fixé au transducteur pour permettre la flexibilité de déplacer librement la plate-forme sur laquelle le rongeur est monté8,24. La conception est basée sur une plate-forme détachable équipée de l’intégration (I) de la plate-forme stéréotaxique des petits animaux (II) marqueurs fiduciaux avec compatibilité aux rayons X et à l’image optique (III) masque d’anesthésie rapide-détachable, et (IV) système de chauffage animal à température réglée intégrée. Après l’induction initiale de l’anesthésie, l’animal est monté dans une position précise sur la plate-forme où il reste pendant toute la procédure. Par conséquent, l’ensemble de la plate-forme passe toutes les stations du flux de travail de l’ensemble de l’intervention, tout en maintenant un positionnement précis et reproductible et une anesthésie soutenue. Le logiciel de contrôle permet la détection automatique des marqueurs fiduciaux et enregistre automatiquement tous les types d’images et de modalités d’image (c’est-à-dire micro-CT, rayons X, BLI et imagerie par fluorescence) dans le cadre de référence de la plate-forme stéréotaxique. À l’aide d’une procédure d’étalonnage automatique, la distance focale du transducteur à ultrasons est précisément connue à l’intérieur, ce qui permet la fusion automatique de la planification interventionnelle, de la livraison acoustique et de l’analyse d’imagerie de suivi. Comme le montrent les figures 1 et 2,cette configuration offre un degré élevé de flexibilité pour concevoir des flux de travail expérimentaux dédiés et permet une manipulation entrelacée de l’animal à différentes stations, ce qui facilite les expériences à haut débit. Nous avons employé cette technique pour la livraison réussie de drogue dans les xénogreffes de souris du glioma à haute teneur tel que le glioma diffus de midline.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL luer-lock syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309628</td>
			<td>Plastipak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>Terumo Agani</td>
			<td>8AN1938R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Terumo Agani</td>
			<td>8AN2316R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Transpore surgical tape</td>
			<td>Science applied to life</td>
			<td>7000032707</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary waveform generator</td>
			<td>Siglent</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated stereotact</td>
			<td>in-house built</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Stereotact with all elements were in-house built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker In-Vivo Xtreme</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Includes software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered NaCl solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG</td>
			<td>220/12257974/110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK limitd</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>0.324 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage enrichment: paper-pulp smart home</td>
			<td>Bio services</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon filter</td>
			<td>Bickford</td>
			<td>NC0111395</td>
			<td>Omnicon f/air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic spoon</td>
			<td>n.a</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, potassium salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VUmc pharmacy</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresenius NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>NaCl 0.9 %, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>Braun Surgical</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Histoacryl 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>324825/324826</td>
			<td>0.5 mL and 0.3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>TEVA Pharmachemie BV</td>
			<td>8711218013196</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>10 %, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2918-11416M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoflon catheter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>391349</td>
			<td>26 GA 0.6 x 19 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Keysight technologies</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>InfiniiVision DSOX024A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation Ltd</td>
			<td>210L</td>
			<td>Model 210L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preamplifier DC Coupler</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n..</td>
			<td>Serial number: DCPS94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sedazine</td>
			<td>AST Farma</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SonoVue microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>8 &#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>various syringes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Indivior UK limitd</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>0.3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>1 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>01-02</td>
			<td>Aquasonic 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic gel</td>
			<td>Bausch + Lomb</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput image-guided stereotactic neuronavigation and focused ultrasound system for blood-brain barrier opening in rodents

La barrière hémato-encéphalique (BHE) a été un obstacle majeur pour le traitement de diverses maladies du cerveau. Les cellules endothéliales, reliées par des jonctions serrées, forment une barrière physiologique empêchant les grosses molécules (>500 Da) de pénétrer dans le tissu cérébral. L’ultrason focalisé médié par microbulles (FUS) peut être employé pour induire une ouverture locale transitoire de BBB, permettant aux drogues plus grandes d’entrer dans le parenchyme de cerveau.
En plus des dispositifs cliniques à grande échelle pour l’application clinique, la recherche préclinique pour l’évaluation de la réponse au traitement des candidats médicaments nécessite des configurations d’échographie dédiées aux petits animaux pour l’ouverture ciblée de la BHE. De préférence, ces systèmes permettent des flux de travail à haut débit avec une précision spatiale élevée ainsi qu’une surveillance intégrée de la cavitation, tout en étant rentables en termes d’investissement initial et de coûts d’exploitation.
Ici, nous présentons un système FUS stéréotaxique de petit animal guidé par bioluminescence et par rayons X qui est basé sur des composants disponibles dans le commerce et répond aux exigences susmentionnées. Un accent particulier a été mis sur un degré élevé d’automatisation facilitant les défis généralement rencontrés dans les études précliniques d’évaluation des médicaments à volume élevé. Des exemples de ces défis sont la nécessité d’une normalisation afin d’assurer la reproductibilité des données, de réduire la variabilité intragroupe, de réduire la taille de l’échantillon et, par conséquent, de se conformer aux exigences éthiques et de réduire la charge de travail inutile. Le système BHE proposé a été validé dans le cadre d’essais d’administration de médicaments facilités par ouverture de BBB sur des modèles de xénogreffe dérivés du patient de glioblastome multiforme et de gliome diffus de midline.

Le système FUS décrit(figure 1 et figure 2)et le flux de travail associé ont été utilisés chez plus de 100 animaux et ont produit des données reproductibles sur des souris saines et porteuses de tumeurs. Sur la base de la cavitation enregistrée et de la densité spectrale aux harmoniques au moment de crête de l’injection de bolus de microbulle, la puissance spectrale de chaque fréquence peut être calculée à l’aide de l’analyse de Fourier comme...

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A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

La barrière hémato-encéphalique (BHE) peut être temporairement perturbée par des ultrasons focalisés médiés par microbulles (FUS). Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour l’ouverture BHE à haut débit in vivo à l’aide d’un système FUS modulaire accessible aux experts non-ultrasons.

Un système de neuronavigation stéréotaxique et d’ultrasons focalisés guidé par image à haut débit pour l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique chez les rongeurs

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

a-high-throughput-image-guided-stereotactic-neuronavigation-focused

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.6K vues.  Cancer Center Amsterdam. La barrière hémato-encéphalique (BHE) peut être temporairement perturbée par des ultrasons focalisés médiés par microbulles (FUS). Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour l’ouverture BHE à haut débit in vivo à l’aide d’un système FUS modulaire accessible aux experts non-ultrasons.

Vidéo: A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Recherche

Neurosciences

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

Évaluation de la perméabilité de la barrière hémato - encéphalique par perfusion intraveineuse d’albumine marquée FITC dans un modèle murin de la maladie neurodégénérative

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Un test In Vivo barrière hémato - encéphalique perméabilité chez la souris à l’aide de fluorescent marqué traceurs

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Une évaluation In Vivo de la perturbation de la barrière hémato - encéphalique dans un modèle de Rat d’accident vasculaire cérébral ischémique

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

Une approche benchtop à l’ouverture spécifique de barrière de cerveau de sang d’emplacement utilisant l’ultrason focal dans un modèle de rat

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly useful for disorders in which identifiable neuronal circuitry plays a key role, such as epilepsy and movement disorders. Currently available surgical modalities, while effective, generally involve an invasive surgical procedure, which can result in surgical injury to non-target tissues. Consequently, it would be of value to expand the range of surgical approaches to include a technique that is both non-invasive and neurotoxic.
Here, a method is presented for producing focal, neuronal lesions in the brain in a non-invasive manner. This approach utilizes low-intensity focused ultrasound together with intravenous microbubbles to transiently and focally open the Blood Brain Barrier (BBB). The period of transient BBB opening is then exploited to focally deliver a systemically administered neurotoxin to a targeted brain area. The neurotoxin quinolinic acid (QA) is normally BBB-impermeable, and is well-tolerated when administered intraperitoneally or intravenously. However, when QA gains direct access to brain tissue, it is toxic to the neurons. This method has been used in rats and mice to target specific brain regions. Immediately after MRgFUS, successful opening of the BBB is confirmed using contrast enhanced T1-weighted imaging. After the procedure, T2 imaging shows injury restricted to the targeted area of the brain and the loss of neurons in the targeted area can be confirmed post-mortem utilizing histological techniques. Notably, animals injected with saline rather than QA do demonstrate opening of the BBB, but dot not exhibit injury or neuronal loss. This method, termed Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) could provide a non-invasive approach for treating neurological disorders associated with disturbances in neural circuitry.

The goal of the protocol is to provide a method for producing non-invasive neuronal lesions in the brain. The method utilizes Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) to open the Blood Brain Barrier in a transient and focal manner, in order to deliver a circulating neurotoxin to the brain parenchyma.

Lésion neuronale ciblée pour la déconnexion non invasive des circuits cérébraux

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Ouverture de la barrière hémato-encéphalique induite par ultrasons focalisés pour cibler les structures cérébrales et évaluer la neuromodulation chimiogénétique

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Un modèle 3D de barrière hémato-encéphalique dérivé de cellules souches pluripotentes humaines

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

Pleins feux sur l’auteur : Une approche personnalisée de l’étude de la maladie d’Alzheimer à l’aide d’un modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

Reconstruction de la barrière hémato-encéphalique in vitro pour modéliser et cibler thérapeutiquement les maladies neurologiques

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...