Questo progetto è stato finanziato dal KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma e High-grade Glioma). Ringraziamo Ilya Skachkov e Charles Mougenot per il loro contributo allo sviluppo del sistema.

Tutti gli esperimenti in vivo sono stati approvati dal comitato etico olandese (numero di permesso di licenza AVD114002017841) e dall'Organismo per il benessere degli animali della Vrije Universiteit Amsterdam, paesi Bassi. Gli investigatori sono stati addestrati alle basi del sistema FUS al fine di ridurre al minimo il disagio degli animali.
1. Sistema ecografico focalizzato
NOTA: La configurazione descritta è un sistema di interruzione BBB integrato basato su componenti disponibili in commercio e include un cono stampato su misura stampato in 3D e una piattaforma stereotassica rimovibile. Il sistema è progettato modulare, il che facilita le modifiche in base alle attrezzature disponibili e all'uso specifico. Il protocollo descrive la procedura per la sonoporazione di un'area più ampia nella regione pontina del cervello del topo. Regolando la posizione del bersaglio, diverse parti del cervello potrebbero essere prese di mira. In questo studio è stato utilizzato un trasduttore mono-elemento a 1 MHz con una lunghezza focale di 75 mm, un'apertura di 60 mm e un'area focale di 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM di pressione di picco). Il piano focale del trasduttore è posizionato attraverso il cranio dell'animale nel piano orizzontale che si interseca con le barre dell'orecchio.
<ol><li>Selezionare un trasduttore appropriato per l'apertura della BBB nei roditori. NOTA: In base alle proprietà delle microbolle e alla frequenza impiegata, le impostazioni acustiche, in particolare l'indice meccanico (MI), sono soggette amodifiche 13,38.</li>
	<li>Posizionare il trasduttore nel cono stampato in 3D.</li>
	<li>Utilizzare una membrana milare acusticamente trasparente all'estremità inferiore del cono per ottenere l'accoppiamento acustico del percorso di propagazione del fascio e riempire il cono con acqua degassata.</li>
	<li>Montare il trasduttore sopra l'animale su uno stadio lineare motorizzato, come mostrato nella figura 1, consentendo il posizionamento verticale automatico del trasduttore.</li>
	<li>Progettare una piattaforma stereotassica rimovibile basata sui requisiti dello studio, che includa riscaldamento regolato dalla temperatura, mordente e auricolari, anestesia e marcatori fiduciari multimodalità, come mostrato nella figura 1 e nella figura 2. Il montaggio della piattaforma stereotassiva è costituito da un sistema di stadio lineare 2D, che consente un posizionamento automatico preciso (< 0,1 mm) dell'animale sotto il fascio.</li>
	<li>Collegare il trasduttore alla catena di emissione acustica mostrata nella figura 1 costituita da un trasduttore, un generatore di funzioni e un amplificatore di potenza.</li>
	<li>Ideare una pipeline di elaborazione delle immagini per rilevare i marcatori fiduciari multimodalità che consenta un targeting preciso della sonoporazione dell'area cerebrale di interesse e la raccolta dei dati di cavitazione rilevati dall'idrofono dell'ago.</li>
	<li>Calibrare il sistema e determinare il punto di messa a fuoco del trasduttore in corrispondenza del posizionamento verticale dell'animale sulla piattaforma stereotassica.</li>
</ol>2. Preparazione animale
NOTA: Il seguente protocollo è specificato per i topi ma può essere adattato per i ratti. Per questi esperimenti sono stati utilizzati topi Foxn1-/- nudi atimici (6-8 settimane).
<ol><li>Consentire all'animale di acclimatarsi per almeno una settimana nella struttura animale e pesare regolarmente l'animale.</li>
	<li>Somministrare buprenorfina (0,05 mg/kg) tramite iniezione sottocutanea (s.c.) 30 minuti prima del trattamento FUS per iniziare il trattamento analgesico.</li>
	<li>Anestetizza l'animale con il 3% di isoflurane, 2 L/min O2 e verifica che l'animale sia profondamente anestetizzato. Mantenere gli animali anestetizzati durante l'intera procedura e monitorare la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca per regolare la concentrazione di isoflurane in base alle esigenze.</li>
	<li>Applicare unguento per gli occhi per prevenire gli occhi asciutti ed evitare possibili lesioni.</li>
	<li>Rimuovere i capelli sulla parte superiore della testa con un rasoio e una crema depilatoria e lavare successivamente con acqua per rimuovere eventuali residui per evitare irritazioni alla pelle.</li>
	<li>Per esperimenti con modelli tumorali BLI, iniettare 150 μL di D-luciferina (30 mg/mL) intraperitoneale (i.p.) con una siringa per insulina da 29 G per la guida dell'immagine BLI.</li>
	<li>Inserire un catetere della vena di coda da 26-30 G e sciacquare il catetere e la vena con un piccolo volume di soluzione di eparina (5 UI/mL). Riempire il catetere con soluzione di eparina per evitare la coagulazione del sangue. NOTA: Una buona cateterizzazione si vede quando c'è un reflusso di sangue nel catetere. Evitare bolle d'aria nel catetere per prevenire gli emboli. Per evitare un'eccessiva pressione di iniezione, assicurarsi che la lunghezza del catetere sia il più breve possibile.</li>
	<li>Posizionare l'animale sulla piattaforma stereotattica regolata dalla temperatura per evitare l'ipotermia. NOTA: L'ipotermia riduce la circolazione sanguigna, che può influenzare l'iniezione / circolazione di microbolle e la farmacocinetica dei farmaci39.</li>
	<li>Immobilizzare e fissare la testa dell'animale sulla piattaforma stereotassiva usando le barre dell'orecchio e una barra del morso. Fissare il corpo con una cinghia e rastremare la coda dell'animale sulla piattaforma.</li>
</ol>3. Ultrasuoni in vivo focalizzati sull'immagine
NOTA: Per questo protocollo è stato utilizzato un trasduttore mono-elemento a 1 MHz con un impulso di scoppio di tono con una durata di 10 ms, un MI di 0,4 e una frequenza di ripetizione dell'impulso di 1,6 Hz con 40 cicli per 240 s. Il protocollo è ottimizzato per le microbolle stabilizzate da fosfolipidi contenenti esafluoruro di zolfo (SF6)come gas innocuo, per cui il diametro medio della bolla è di 2,5 μm e più del 90% delle bolle sono più piccole di 8 μm.
<ol><li>Posizionare la piattaforma stereotassica con l'animale montato nella modalità di imaging (adesempio, BLI o raggi X) e scattare l'immagine o le immagini dell'animale.</li>
	<li>Utilizzare i marcatori fiduciari multimodalità in combinazione con la pipeline di elaborazione delle immagini per contrassegnare la posizione dell'animale in base al punto di messa a fuoco del trasduttore.</li>
	<li>Determinare l'area di destinazione posizionando un contorno cerebrale sull'immagine a raggi X acquisita o utilizzando immagini BLI per determinare il centro del tumore (Figura 2). La posizione di parti specifiche del cervello è specificata nel Paxinos Brain Atlas40 usando i segni del cranio bregma e lambda come punti di riferimento. Ad esempio, i pons si trovano x=-1.0, y=-0.8 e z=-4.5 da lambda.</li>
	<li>Proteggi le narici e la bocca dell'animale con nastro adesivo per evitare che il gel ad ultrasuoni interferisca con la respirazione.</li>
	<li>Applicare il gel ad ultrasuoni sopra la testa dell'animale.</li>
	<li>Ritrarre la pelle del collo degli animali, lubrificare l'idrofono dell'ago con gel ad ultrasuoni e posizionare l'idrofono dell'ago nelle immediate vicinanze dell'osso occipitale.</li>
	<li>Guida il trasduttore nella posizione corretta utilizzando la tubazione di elaborazione delle immagini e il punto di messa a fuoco.</li>
	<li>Applicare le impostazioni preconfigurate a tutti i dispositivi collegati e indirizzare l'area cerebrale di interesse. NOTA: A seconda della domanda di ricerca, le regioni tumorali o cerebrali possono essere sonoporate come un singolo punto focale o come forma volumetrica, come mostrato nella figura 2.</li>
	<li>Attivare le microbolle come descritto dal produttore. Iniettare un bolo di 120 μL (5,4 μg) di microbolle.</li>
	<li>Lavare il catetere della vena di coda con soluzione salina per controllare l'apertura del catetere.</li>
	<li>Iniettare le microbolle e iniziare l'insonation.</li>
	<li>Registrare la cavitazione delle microbolle con l'idrofono dell'ago.</li>
	<li>Somministrare un agente di contrasto intravascolare o un farmaco dopo la sonoporazione. La dose, i tempi e la pianificazione dipendono dallo scopo dello studio e dal farmaco. NOTA: Evans blue è un agente di colore comune per valutare l'apertura BBB41.</li>
	<li>Monitorare l'animale fino al punto di tempo predeterminato o prima dell'endpoint umano.</li>
</ol>4. Analisi della cavitazione delle microbolle
NOTA: Qui viene descritta la procedura applicata, che è adatta per la sperimentazione in vivo di microbolle SF6-fosfolipidi con un diametro medio di 2,5 μm (80% delle bolle inferiori a 8 μm) eccitate con un impulso di tono burst di 10 ms di durata ad una frequenza di 1 MHz, come originariamente suggerito da McDannold etal.
<ol><li>Trasformazione di Fourier del segnale PCD registrato dal dominio del tempo nel dominio della frequenza.</li>
	<li>Integrare la potenza spettrale risultante per il rilevamento della cavitazione stabile intornoall'armonica 2 ° e 3rd (± 50 kHz), come mostrato nella figura 3 (scatola verde a 2 e 3 MHz).</li>
	<li>Integrare la potenza spettrale peril rilevamento della cavitazione inerziale, tra la frequenza principale, la2a, 3aarmonica, la 1a e la seconda ultraarmonica e la prima sub-armonica (± 150 kHz), come mostrato nella figura 3 (caselle rosse).</li>
	<li>Integrare la potenza spettrale attorno alla frequenza principale (1 MHz ± 50 kHz) per la normalizzazione di entrambi i segnali PCD precedentemente ottenuti. NOTA: Il segnale PCD, per microbolle SF6-fosfolipidiche in esperimenti in vivo a 1 MHz, non visualizza ultraarmonici o sottoarmonici prima che la cavitazione inerziale si insepol, come mostrato nella figura 3.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo studio, abbiamo sviluppato un sistema FUS basato su immagini economico per interruzioni transitorie della BBB per aumentare il consumo di farmaci nel parenchima cerebrale. Il sistema è stato in gran parte costruito con componenti disponibili in commercio e in combinazione con raggi X e BLI. La modularità del progetto proposto consente l'utilizzo di diverse modalità di imaging per la pianificazione e la valutazione in flussi di lavoro ad alta produttività. Il sistema può essere combinato con modalità di im...

La barriera ematica-encefalica (BBB) è un grosso ostacolo per il somministrazione di farmaci nel parenchima cerebrale. La maggior parte dei farmaci terapeutici che sono stati sviluppati non attraversano la BBB a causa dei loro parametri fisicochimici (ad esempio, lipofilia, peso molecolare, accettori di legami idrogeno e donatori) o non vengono mantenuti a causa della loro affinità per i trasportatori di efflux nelcervello 1,2. Il piccolo gruppo di farmaci che possono attraversare la BBB sono tipicamente piccole molecole lipofile, che sono efficaci solo in un numero limitato di malattiecerebrali 1,2. Di conseguenza, per la maggior parte delle malattie cerebrali, le opzioni di trattamento farmacologico sono limitate e sono necessarie nuove strategie disomministrazione dei farmaci 3,4.
L'ecografia terapeutica è una tecnica emergente che può essere utilizzata per diverse applicazioni neurologiche come l'interruzione della BBB (BBBD), la neuromodulazione e l'ablazione4,5,6,7. Al fine di ottenere un'apertura BBB con un emettitore ad ultrasuoni extracorporeo attraverso il cranio, gli ultrasuoni focalizzati (FUS) sono combinati con microbolle. Il FUS mediato da microbolle si traduce in una maggiore biodisponibilità di farmaci nel parenchimacerebrale 5,8,9. In presenza di onde sonore, le microbolle iniziano a oscillare iniziando la tracitosi e l'interruzione delle giunzioni strette tra le cellule endoteliali della BBB, consentendo il trasporto paracellulare di molecole piùgrandi 10. Studi precedenti hanno confermato la correlazione tra l'intensità dell'emissione acustica e l'impatto biologico sull'apertura della BBB11,12,13,14. FUS in combinazione con microbolle è già stato utilizzato in studi clinici per il trattamento del glioblastoma utilizzando temozolomide o doxorubicina liposomiale come agente chemioterapico, o per la terapia del morbo di Alzheimer e sclerosi laterale amiotrofica5,9,15,16.
Poiché l'apertura della BBB mediata da ultrasuoni si traduce in possibilità completamente nuove per la farmacoterapia, è necessaria una ricerca preclinica per la traduzione clinica per valutare la risposta terapeutica di candidati selezionati. Ciò richiede in genere un flusso di lavoro ad alta produttività con precisione sia spaziale elevata che preferibilmente un rilevamento di cavitazione integrato per il monitoraggio dell'apertura BBB mirata con un'elevata riproducibilità. Se possibile, questi sistemi devono essere convenienti sia per gli investimenti iniziali che per i costi di gestione per essere scalabili in base alle dimensioni dello studio. La maggior parte dei sistemi FUS preclinici sono combinati con la risonanza prima della mento per la guida delle immagini e lapianificazione del trattamento 15,17,18,19. Sebbene la risonanza tura dia informazioni dettagliate sull'anatomia e sul volume del tumore, è una tecnica costosa, che viene generalmente eseguita da operatori addestrati / qualificati. Inoltre, la risonanza prima o poi ad alta risoluzione potrebbe non essere sempre disponibile per i ricercatori in strutture precliniche e richiede lunghi tempi di scansione per animale, rendendola meno adatta per studi farmacologici ad alta produttività. Degno di nota è che, per la ricerca preclinica nel campo della neuro-oncologia, in particolare dei modelli tumorali infiltrativi, la possibilità di visualizzare e indirizzare il tumore è essenziale per il successodel trattamento 20. Attualmente, questo requisito è soddisfatto solo dalla risonanza magnetica o da tumori trasdotti con una fotoproteina, consentendo la visualizzazione con imaging a bioluminescenza (BLI) in combinazione con la somministrazione del substrato di fotoproteina.
I sistemi FUS guidati dalla risonanza 10 utilizzano spesso un bagno d'acqua per garantire la propagazione delle onde ultrasoniche per applicazioni transcranici, in cui la testa dell'animale è parzialmente sommersa nell'acqua, i cosiddetti sistemi "bottom-up"15,17,18. Mentre questi progetti funzionano generalmente bene negli studi sugli animali più piccoli, sono un compromesso tra tempi di preparazione degli animali, portabilità e standard igienici realisticamente manutenibili durante l'uso. In alternativa alla risonanza valutazione, altri metodi di guida per la navigazione stereotassica comprendono l'uso di un atlante anatomico roditore21,22,23, avvistamento visivo assistito da puntatore laser24,dispositivo di scansione meccanica assistito da fori stenopeico25o BLI26. La maggior parte di questi disegni sono sistemi "top-down" in cui il trasduttore è posto sopra la testa dell'animale, con l'animale in posizione naturale. Il flusso di lavoro "dall'alto verso il basso" è costituito da un bagnod'acqua 22,25,26 o da un cono riempito d'acqua21,24. Il vantaggio dell'utilizzo di un trasduttore all'interno di un cono chiuso è l'ingombro più compatto, i tempi di configurazione più brevi e le possibilità di decontaminazione diretta semplificando l'intero flusso di lavoro.
L'interazione del campo acustico con le microbolle dipende dalla pressione e varia dalle oscillazioni a bassa ampiezza (indicate come cavitazione stabile) al collasso transitorio della bolla (indicato come cavitazione inerziale)27,28. Esiste un consenso consolidato sul fatto che l'ecografia-BBBD richiede una pressione acustica ben al di sopra della soglia di cavitazione stabile per ottenere un BBBD di successo, ma al di sotto della soglia di cavitazione inerziale, che è generalmente associata a danni vascolari /neuronali 29. La forma più comune di monitoraggio e controllo è l'analisi del segnale acustico (back-)scattered utilizzando il rilevamento passivo della cavitazione (PCD), come suggerito da McDannold etal. La PCD si basa sull'analisi degli spettri di Fourier dei segnali di emissione di microbolle, in cui la forza e l'aspetto dei tratti distintivi di cavitazione stabili (armoniche, sottoarmoniche e ultraarmoniche) e dei marcatori di cavitazione inerziale (risposta a banda larga) possono essere misurati in tempo reale.
Un'analisi PCD "one size fits all" per un controllo preciso della pressione è complicata a causa della polidispersità della formulazione di microbolle (l'ampiezza di oscillazione dipende fortemente dal diametro della bolla), dalle differenze nelle proprietà del guscio della bolla tra le marche e dall'oscillazione acustica, che dipende fortemente dallafrequenza e dalla pressione 30,31,32. Di conseguenza, sono stati suggeriti molti diversi protocolli di rilevamento PCD, che sono stati adattati a particolari combinazioni di tutti questi parametri e sono stati utilizzati in vari scenari applicativi (che vanno dalla sperimentazione in vitro su piccoli protocolli animali alla PCD per uso clinico) per il rilevamento robusto della cavitazione e persino per il controllo retroattivo del feedbackdella pressione 11,14,30,31,32,33,34,35. Il protocollo PCD utilizzato nell'ambito di questo studio è derivatodirettamente da McDannold et al.
Abbiamo sviluppato un sistema FUS di neuronavigation guidato da immagini per l'apertura transitoria della BBB per aumentare il consumo di farmaci nel parenchima cerebrale. Il sistema si basa su componenti disponibili in commercio e può essere facilmente adattato a diverse modalità di imaging, a seconda delle tecniche di imaging disponibili nella struttura animale. Poiché abbiamo bisogno di un flusso di lavoro ad alta produttività, abbiamo scelto di utilizzare raggi X e BLI per la guida delle immagini e la pianificazione del trattamento. Le cellule tumorali trasdute con una fotoproteina (ad esempio, luciferasi) sono adatte per l'imaging BLI20. Dopo la somministrazione del substrato di fotoproteina, le cellule tumorali possono essere monitorate in vivo e la crescita e la posizione del tumorepossono essere determinate 20,36. BLI è una modalità di imaging a basso costo, consente di seguire la crescita tumorale nel tempo, ha tempi di scansione rapidi e si correla bene con la crescita tumorale misurata con la risonanzamagnetica 36,37. Abbiamo optato per sostituire il bagno d'acqua con un cono pieno d'acqua attaccato al trasduttore per consentire flessibilità per spostare liberamente la piattaforma su cui èmontato il roditore 8,24. Il design si basa su una piattaforma rimovibile dotata di integrazione di (I) marcatori fiduciari della piattaforma stereotattica per piccoli animali (II) con compatibilità a raggi X e immagini ottiche (III) maschera di anestesia rapidamente rimovibile e (IV) sistema integrato di riscaldamento degli animali regolato dalla temperatura. Dopo l'induzione iniziale dell'anestesia, l'animale viene montato in una posizione precisa sulla piattaforma dove rimane durante l'intera procedura. Di conseguenza, l'intera piattaforma passa tutte le stazioni del flusso di lavoro dell'intero intervento, pur mantenendo un posizionamento accurato e riproducibile e un'anestesia sostenuta. Il software di controllo consente il rilevamento automatico dei marcatori fiduciari e registra automaticamente tutti i tipi di immagini e modalità di immagine (ad esempio, micro-CT, raggi X, BLI e imaging a fluorescenza) nel quadro di riferimento della piattaforma stereotassica. Con l'aiuto di una procedura di calibrazione automatica, la lunghezza focale del trasduttore ad ultrasuoni è precisamente nota all'interno, il che consente la fusione automatica della pianificazione interventiva, della consegna acustica e dell'analisi di imaging di follow-up. Come illustrato nella figura 1 e nella figura 2, questa configurazione offre un elevato grado di flessibilità per progettare flussi di lavoro sperimentali dedicati e consente la manipolazione interfogliata dell'animale in diverse stazioni, il che a sua volta facilita gli esperimenti ad alta produttività. Abbiamo usato questa tecnica per il successo della somministrazione di farmaci negli xenografti di topo di glioma di alta qualità come il glioma medioline diffuso.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL luer-lock syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309628</td>
			<td>Plastipak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>Terumo Agani</td>
			<td>8AN1938R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Terumo Agani</td>
			<td>8AN2316R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Transpore surgical tape</td>
			<td>Science applied to life</td>
			<td>7000032707</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary waveform generator</td>
			<td>Siglent</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated stereotact</td>
			<td>in-house built</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Stereotact with all elements were in-house built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker In-Vivo Xtreme</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Includes software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered NaCl solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG</td>
			<td>220/12257974/110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK limitd</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>0.324 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage enrichment: paper-pulp smart home</td>
			<td>Bio services</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon filter</td>
			<td>Bickford</td>
			<td>NC0111395</td>
			<td>Omnicon f/air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic spoon</td>
			<td>n.a</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, potassium salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VUmc pharmacy</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresenius NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>NaCl 0.9 %, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>Braun Surgical</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Histoacryl 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>324825/324826</td>
			<td>0.5 mL and 0.3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>TEVA Pharmachemie BV</td>
			<td>8711218013196</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>10 %, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2918-11416M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoflon catheter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>391349</td>
			<td>26 GA 0.6 x 19 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Keysight technologies</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>InfiniiVision DSOX024A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation Ltd</td>
			<td>210L</td>
			<td>Model 210L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preamplifier DC Coupler</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n..</td>
			<td>Serial number: DCPS94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sedazine</td>
			<td>AST Farma</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SonoVue microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>8 &#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>various syringes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Indivior UK limitd</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>0.3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>1 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>01-02</td>
			<td>Aquasonic 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic gel</td>
			<td>Bausch + Lomb</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput image-guided stereotactic neuronavigation and focused ultrasound system for blood-brain barrier opening in rodents

La barriera ematica-encefalica (BBB) è stato un grosso ostacolo per il trattamento di varie malattie cerebrali. Le cellule endoteliali, collegate da giunzioni strette, formano una barriera fisiologica che impedisce alle grandi molecole (>500 Da) di entrare nel tessuto cerebrale. Gli ultrasuoni focalizzati mediati da microbolle (FUS) possono essere utilizzati per indurre un'apertura BBB locale transitoria, consentendo ai farmaci più grandi di entrare nel parenchima cerebrale.
Oltre ai dispositivi clinici su larga scala per la traduzione clinica, la ricerca preclinica per la valutazione della risposta terapeutica dei candidati ai farmaci richiede configurazioni dedicate di ultrasuoni per piccoli animali per un'apertura BBB mirata. Preferibilmente, questi sistemi consentono flussi di lavoro ad alta produttività con precisione spaziale elevata e monitoraggio integrato della cavitazione, pur essendo convenienti sia nell'investimento iniziale che nei costi di gestione.
Qui presentiamo un sistema FUS per piccoli animali stereotattico a bioluminescenza e a raggi X che si basa su componenti disponibili in commercio e soddisfa i suddetti requisiti. Un'enfasi particolare è stata posta su un elevato grado di automazione che facilita le sfide tipicamente incontrate negli studi preclinici di valutazione dei farmaci ad alto volume. Esempi di queste sfide sono la necessità di standardizzazione al fine di garantire la riproducibilità dei dati, ridurre la variabilità all'interno del gruppo, ridurre le dimensioni del campione e quindi rispettare i requisiti etici e ridurre il carico di lavoro non necessario. Il sistema BBB proposto è stato convalidato nell'ambito di BBB aprendo studi di somministrazione facilitata di farmaci su modelli di xenograft derivati dal paziente di glioblastoma multiforme e glioma medioline diffuso.

Il sistema FUS descritto (Figura 1 e Figura 2) e il flusso di lavoro associato sono stati utilizzati in oltre 100 animali e hanno prodotto dati riproducibili su topi sani e portanti di tumore. In base alla cavitazione registrata e alla densità spettrale alle armoniche nel momento di picco dell'iniezione di bolo di microbolle, la potenza spettrale di ogni frequenza può essere calcolata utilizzando l'analisi di Fourier come spiegato nella fase 4 del protocollo. ...

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A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

La barriera ematico-encefalica (BBB) può essere temporaneamente interrotta con ultrasuoni focalizzati mediati da microbolle (FUS). Qui descriviamo un protocollo passo-passo per l'apertura BBB ad alta produttività in vivo utilizzando un sistema FUS modulare accessibile per esperti non ad ultrasuoni.

Un neuronavigation stereotattico guidato da immagini ad alta produttività e un sistema ad ultrasuoni focalizzati per l'apertura della barriera ematico-encefalica nei roditori

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

a-high-throughput-image-guided-stereotactic-neuronavigation-focused

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.6K Views.  Cancer Center Amsterdam. La barriera ematico-encefalica (BBB) può essere temporaneamente interrotta con ultrasuoni focalizzati mediati da microbolle (FUS). Qui descriviamo un protocollo passo-passo per l'apertura BBB ad alta produttività in vivo utilizzando un sistema FUS modulare accessibile per esperti non ad ultrasuoni.

Video: A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

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Neuroscienze

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

Valutazione della permeabilità della barriera emato - encefalica dall'infusione endovenosa di albumina FITC-labeled in un modello murino di malattia di Neurodegenerative

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Una valutazione In Vivo di rottura della barriera emato - encefalica in un modello del ratto del colpo ischemico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

Un approccio da banco all'apertura della barriera ematica specifica della posizione utilizzando ultrasuoni focalizzati in un modello di ratto

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly useful for disorders in which identifiable neuronal circuitry plays a key role, such as epilepsy and movement disorders. Currently available surgical modalities, while effective, generally involve an invasive surgical procedure, which can result in surgical injury to non-target tissues. Consequently, it would be of value to expand the range of surgical approaches to include a technique that is both non-invasive and neurotoxic.
Here, a method is presented for producing focal, neuronal lesions in the brain in a non-invasive manner. This approach utilizes low-intensity focused ultrasound together with intravenous microbubbles to transiently and focally open the Blood Brain Barrier (BBB). The period of transient BBB opening is then exploited to focally deliver a systemically administered neurotoxin to a targeted brain area. The neurotoxin quinolinic acid (QA) is normally BBB-impermeable, and is well-tolerated when administered intraperitoneally or intravenously. However, when QA gains direct access to brain tissue, it is toxic to the neurons. This method has been used in rats and mice to target specific brain regions. Immediately after MRgFUS, successful opening of the BBB is confirmed using contrast enhanced T1-weighted imaging. After the procedure, T2 imaging shows injury restricted to the targeted area of the brain and the loss of neurons in the targeted area can be confirmed post-mortem utilizing histological techniques. Notably, animals injected with saline rather than QA do demonstrate opening of the BBB, but dot not exhibit injury or neuronal loss. This method, termed Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) could provide a non-invasive approach for treating neurological disorders associated with disturbances in neural circuitry.

The goal of the protocol is to provide a method for producing non-invasive neuronal lesions in the brain. The method utilizes Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) to open the Blood Brain Barrier in a transient and focal manner, in order to deliver a circulating neurotoxin to the brain parenchyma.

Lesioni neuronali mirate per la disconnessione non invasiva dei circuiti cerebrali

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Apertura della barriera emato-encefalica indotta da ultrasuoni focalizzati per il targeting delle strutture cerebrali e la valutazione della neuromodulazione chemiogenetica

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Un modello 3D di barriera emato-encefalica derivato da cellule staminali pluripotenti umane

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

Autore in primo piano: Un approccio personalizzato verso lo studio della malattia di Alzheimer utilizzando un modello di barriera emato-encefalica in vitro 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...