Este projeto foi financiado pelo KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrínsic Pontine Glioma and High-grade Glioma). Agradecemos a Ilya Skachkov e Charles Mougenot por sua contribuição no desenvolvimento do sistema.

Todos os experimentos in vivo foram aprovados pelo comitê de ética holandês (número de licenças AVD114002017841) e pelo Corpo de Bem-Estar Animal da Vrije Universiteit Amsterdam, nos Países Baixos. Os investigadores foram treinados no básico do sistema de FUS, a fim de minimizar o desconforto dos animais.
1. Sistema de ultrassom focado
NOTA: A configuração descrita é um sistema de disrupção BBB construído em casa com base em componentes disponíveis comercialmente e inclui um cone personalizado impresso em 3D e uma plataforma estereotática destacável. O sistema é projetado modular, o que facilita modificações de acordo com equipamentos disponíveis e uso específico. O protocolo descreve o procedimento para a sonoporação de uma área maior na região pontina do cérebro do camundongo. Ajustando o local alvo, diferentes partes do cérebro podem ser alvo. Neste estudo foi utilizado um transdutor mono-elemento de 1 MHz com distância focal de 75 mm, abertura de 60 mm e área focal de 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM de pressão máxima). O plano focal do transdutor é posicionado através do crânio do animal no plano horizontal cruzando com as barras de ouvido.
<ol><li>Selecione um transdutor apropriado para abertura BBB em roedores. NOTA: Com base nas propriedades dos microbolhas e na frequência empregada, as configurações acústicas, em especial o índice mecânico (MI), estão sujeitas a alterações13,38.</li>
	<li>Coloque o transdutor no cone impresso em 3D.</li>
	<li>Empregue uma membrana mylar acústicamente transparente na extremidade inferior do cone para obter o acoplamento acústico do caminho de propagação do feixe, e encha o cone com água desgassada.</li>
	<li>Monte o transdutor acima do animal em um estágio linear motorizado, como mostrado na Figura 1 permitindo o posicionamento vertical automático do transdutor.</li>
	<li>Projete uma plataforma estereotática destacável com base nos requisitos do estudo, que inclui aquecimento regulado pela temperatura, barras de mordida e ouvido, anestesia e marcadores fiduciais multi-modalidade, como mostrado na Figura 1 e Figura 2. A montagem da plataforma estereotática consiste em um sistema de estágio linear 2D, que permite um posicionamento automático preciso (< 0,1 mm) do animal sob o feixe.</li>
	<li>Conecte o transdutor à cadeia de emissão acústica mostrada na Figura 1, composta por um transdutor, um gerador de função e um amplificador de energia.</li>
	<li>Crie um pipeline de processamento de imagem para detectar os marcadores fiduciais multi-modalidade que permitem a sonoraporção precisa visando a área de interesse do cérebro e coleta dos dados de cavitação detectados pelo hidrofone da agulha.</li>
	<li>Calibrar o sistema e determinar o ponto de foco do transdutor em correspondência ao posicionamento vertical do animal na plataforma estereotática.</li>
</ol>2. Preparação animal
NOTA: O seguinte protocolo é especificado para ratos, mas pode ser adaptado para ratos. Para esses experimentos, foram utilizados ratos nus atímicos foxn1-/- ratos (6-8 semanas de idade).
<ol><li>Permita que o animal se aclimata por pelo menos uma semana na instalação animal e pese o animal regularmente.</li>
	<li>Administre a injeção de buprenorfina (0,05 mg/kg) através de injeção subcutânea (s.c.) 30 min antes do tratamento de FUS para iniciar o tratamento analgésico.</li>
	<li>Anestesiar o animal com 3% de isoflurane, 2 L/min O2 e verificar se o animal está profundamente anestesiado. Mantenha os animais anestesiados durante todo o procedimento e monitore a frequência respiratória e a frequência cardíaca para ajustar a concentração de isoflurane conforme necessário.</li>
	<li>Aplique pomada ocular para evitar olhos secos e evite possíveis lesões.</li>
	<li>Retire o cabelo na parte superior da cabeça com uma navalha e creme depilatório e lave depois com água para remover quaisquer resíduos para evitar irritação na pele.</li>
	<li>Para experimentos com modelos de tumor BLI, injete 150 μL de D-luciferin (30 mg/mL) intraperitoneal (i.p.) com uma seringa de insulina de 29 G para orientação de imagem BLI.</li>
	<li>Insira um cateter de veias traseiras de 26-30 G e lave o cateter e a veia com um pequeno volume de solução de heparina (5 UI/mL). Encha o cateter com solução de heparina para evitar a coagulação sanguínea. NOTA: Um bom cateterismo é visto quando há um refluxo de sangue no cateter. Evite bolhas de ar no cateter para evitar embolias. Para evitar pressão excessiva de injeção, certifique-se de que o comprimento do cateter seja o mais curto possível.</li>
	<li>Coloque o animal na plataforma estereotática regulada pela temperatura para evitar hipotermia. NOTA: A hipotermia reduz a circulação sanguínea, o que pode afetar a injeção/circulação de microbolhas e a farmacocinética dos medicamentos39.</li>
	<li>Imobilize e conserte a cabeça do animal na plataforma estereotática usando barras de ouvido e uma barra de mordida. Fixar o corpo com uma alça e amarrar a cauda do animal na plataforma.</li>
</ol>3. Ultrassom focado em imagem in vivo
NOTA: Para este protocolo foi utilizado um transdutor mono-elemento de 1 MHz com pulso de explosão de tom com duração de 10 ms, um MI de 0,4 e uma frequência de repetição de pulso de 1,6 Hz com 40 ciclos para 240 s. O protocolo é otimizado para microbolhas estabilizadas por fosfolipídios contendo hexafluoreto de enxofre (SF6) como um gás inócuo, pelo qual o diâmetro médio da bolha é de 2,5 μm e mais de 90% das bolhas são menores que 8 μm.
<ol><li>Coloque a plataforma estereotática com o animal montado na modalidade de imagem (porexemplo, BLI ou raio-X) e tire a imagem do animal.</li>
	<li>Use os marcadores fiduciais multi-modalidade em combinação com o pipeline de processamento de imagem para marcar a posição do animal de acordo com o ponto de foco do transdutor.</li>
	<li>Determine a área alvo colocando um contorno cerebral sobre a imagem de raio-X adquirida ou usando imagens BLI para determinar o centro do tumor (Figura 2). A posição de partes específicas do cérebro são especificadas no Paxinos Brain Atlas40 usando as marcas do crânio bregma e lambda como pontos de referência. Por exemplo, os pons estão localizados x=-1.0, y=-0,8 e z=-4,5 de lambda.</li>
	<li>Proteja as narinas e a boca do animal com fita adesiva para evitar que o gel de ultrassom interfira na respiração.</li>
	<li>Aplique gel de ultrassom em cima da cabeça do animal.</li>
	<li>Retraia a pele do pescoço dos animais, lubrifica o hidrofone da agulha com gel de ultrassom e coloca o hidrofone da agulha nas proximidades diretas do osso occipital.</li>
	<li>Guie o transdutor até a posição correta usando o pipeline de processamento de imagem e o ponto de foco.</li>
	<li>Aplique as configurações pré-configuradas em todos os dispositivos conectados e direja a região do cérebro de interesse. NOTA: Dependendo da questão da pesquisa, as regiões tumorais ou cerebrais podem ser sonoporadas como um único ponto focal ou como forma volumosa, como mostrado na Figura 2.</li>
	<li>Ative microcompletos conforme descrito pelo fabricante. Injete um bolus de 120 μL (5,4 μg) de microbolhas.</li>
	<li>Lave o cateter da veia da cauda com soro fisiológico para verificar a abertura do cateter.</li>
	<li>Injete os microbolhas e inicie a insstilação.</li>
	<li>Registo de microbolhas com o hidrofone da agulha.</li>
	<li>Administre um agente de contraste intravascular ou uma droga após a sonoporação. A dose, o tempo e o planejamento dependem da finalidade do estudo e da droga. NOTA: O azul evans é um agente de cores comum para avaliar a abertura do BBB41.</li>
	<li>Monitore o animal até o ponto de tempo predeterminado ou antes do ponto final humano.</li>
</ol>4. Análise da cavitação de microbolhas
NOTA: Aqui está descrito o procedimento aplicado, que é adequado para experimentação in vivo para microbolhas SF6-fosfolipid com diâmetro médio de 2,5 μm (80% das bolhas abaixo de 8 μm) animado com um pulso de tom de explosão de 10 ms de duração em uma frequência de 1 MHz, como originalmente sugerido por McDannold et al.12.
<ol><li>Transforme o sinal PCD gravado do domínio de tempo para o domínio de frequência.</li>
	<li>Integre a potência espectral resultante para detecção estável de cavitação em torno da harmônica2ª e3ª (± 50 kHz), como mostrado na Figura 3 (caixa verde a 2 e 3 MHz).</li>
	<li>Integre a potência espectral para detecção de cavitação inercial, entre a frequência principal, a2ª, a3ª harmônica, a1ª ea 2ª ultraarmônica e a primeira sub-harmônica (± 150 kHz), como mostrado na Figura 3 (caixas vermelhas).</li>
	<li>Integre a potência espectral em torno da frequência principal (1 MHz ± 50 kHz) para a normalização de ambos os sinais PCD obtidos anteriormente. NOTA: O sinal PCD, para microbolhas SF6-fosfolipid in vivo experimentos a 1 MHz, não exibe ultraharmônicas ou subharmônicas antes que a cavitação inercial se instale, como mostrado na Figura 3.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste estudo, desenvolvemos um sistema de FUS baseado em imagem econômico para interrupção transitória do BBB para o aumento da entrega de medicamentos no parênquim cerebral. O sistema foi construído em grande parte com componentes comercialmente disponíveis e em conjunto com raio-X e BLI. A modularidade do projeto proposto permite o uso de diversas modalidades de imagem para planejamento e avaliação em fluxos de trabalho de alto rendimento. O sistema pode ser combinado com modalidades de imagem 3D de alta resol...

A barreira hematoencefálica (BBB) é um grande obstáculo para a entrega de drogas no cérebro. A maioria das drogas terapêuticas desenvolvidas não atravessam o BBB devido aos seus parâmetros físico-químicos (por exemplo, lipoficidade, peso molecular, aceitadores de vínculos de hidrogênio e doadores) ou não são retidos devido à sua afinidade com transportadores efflux no cérebro1,2. O pequeno grupo de drogas que podem atravessar o BBB são tipicamente pequenas moléculas lipofílicas, que só são eficazes em um número limitado de doenças cerebrais1,2. Como consequência, para a maioria das doenças cerebrais, as opções de tratamento farmacológico são limitadas e novas estratégias de entrega de medicamentos são necessárias3,4.
O ultrassom terapêutico é uma técnica emergente que pode ser usada para diferentes aplicações neurológicas, como ruptura BBB (BBBD), neuromodulação e ablação4,5,6,7. Para conseguir uma abertura BBB com um emissor de ultrassom extracorpórea através do crânio, o ultrassom focado (FUS) é combinado com microbolhas. O MEC mediado por microconstrução resulta no aumento da biodisponibilidade de drogas no cérebro parenchyma5,8,9. Na presença de ondas sonoras, os microbolhas começam a oscilar iniciando a transcitose e a interrupção das junções apertadas entre as células endoteliais do BBB, permitindo o transporte paracelular de moléculas maiores10. Estudos anteriores confirmaram a correlação entre a intensidade da emissão acústica e o impacto biológico na abertura do BBB11,12,13,14. O FUS em combinação com microbolhas já tem sido utilizado em ensaios clínicos para o tratamento de glioblastoma usando temozolomide ou doxorubicina liposômica como agente quimioterápico, ou para terapia da doença de Alzheimer e esclerose lateral amiotrófica5,9,15,16.
Uma vez que a abertura do BBB mediado pelo ultrassom resulta em possibilidades totalmente novas para farmacoterapia, é necessária pesquisa pré-clínica para tradução clínica para avaliar a resposta terapêutica de candidatos a medicamentos selecionados. Isso normalmente requer um fluxo de trabalho de alto rendimento com precisão espacial elevada e, preferencialmente, uma detecção integrada de cavitação para monitoramento da abertura do BBB com uma alta reprodutibilidade. Se possível, esses sistemas precisam ser econômicos tanto no investimento inicial quanto nos custos de execução, para serem escaláveis de acordo com o tamanho do estudo. A maioria dos sistemas de FUS pré-clínicos são combinados com ressonância magnética para orientação de imagem e planejamento de tratamento15,17,18,19. Embora a ressonância magnética dê informações detalhadas sobre a anatomia e o volume do tumor, é uma técnica cara, que geralmente é realizada por operadores treinados/qualificados. Além disso, a ressonância magnética de alta resolução pode nem sempre estar disponível para pesquisadores em instalações pré-clínicas e requer longos tempos de varredura por animal, tornando-o menos adequado para estudos farmacológicos de alto rendimento. Destaca-se que, para pesquisas pré-clínicas no campo da neuro-oncologia, em especial modelos de tumores infiltrados, a possibilidade de visualizar e atingir o tumor é essencial para o sucesso do tratamento20. Atualmente, essa exigência só é cumprida por ressonância magnética ou por tumores transduzidos com fotoproteína, possibilitando visualização com bioluminescência de imagem (BLI) em combinação com a administração do substrato de fotoproteína.
Os sistemas de FUS guiados por ressonância magnética frequentemente usam um banho de água para garantir a propagação de ondas de ultrassom para aplicações transcranianas, em que a cabeça do animal está parcialmente submersa na água, os chamados sistemas ''bottom-up''15,17,18. Embora esses projetos funcionem geralmente bem em estudos em animais menores, eles são um compromisso entre os tempos de preparação animal, portabilidade e padrões higiênicos realisticamente mantidos durante o uso. Como alternativa à ressonância magnética, outros métodos de orientação para navegação estereotática abrangem o uso de um atlas anatômico de roedores21,22,23, ponteiro laser assistido ao avistamento visual24, dispositivo de varredura mecânica assistido por pinhole25, ou BLI26. A maioria desses desenhos são sistemas "de cima para baixo" em que o transdutor é colocado em cima da cabeça do animal, com o animal em uma posição natural. O fluxo de trabalho ''top-down'' consiste em um banho de água22,25,26 ou um cone cheio de água21,24. O benefício de usar um transdutor dentro de um cone fechado é a pegada mais compacta, menor tempo de configuração e possibilidades de descontaminação direta simplificando todo o fluxo de trabalho.
A interação do campo acústico com os microbolhas é dependente da pressão e varia de oscilações de baixa amplitude (chamada de cavitação estável) ao colapso transitório da bolha (referido como cavitação inercial)27,28. Há um consenso estabelecido de que o ultrassom-BBBD requer uma pressão acústica bem acima do limiar de cavitação estável para alcançar o sucesso do BBBD, mas abaixo do limiar de cavitação inercial, que geralmente está associado a danos vasculares/neuronais29. A forma mais comum de monitoramento e controle é a análise do (back-)sinal acústico disperso utilizando detecção passiva de cavitação (PCD), conforme sugerido por McDannold et al.12. O PCD baseia-se na análise dos espectros fourier de sinais de emissão de microbolhas, nos quais a força e o aparecimento de marcas de cavitação estáveis (harmônicas, subharmônicas e ultraharmônicas) e marcadores de cavitação inercial (resposta de banda larga) podem ser medidos em tempo real.
Uma análise de PCD "de um tamanho" para controle preciso de pressão é complicada devido à polidispersidade da formulação de microbolhas (a amplitude de oscilação depende fortemente do diâmetro da bolha), as diferenças nas propriedades da casca de bolha entre as marcas e a oscilação acústica, que depende fortemente da frequência e da pressão30,31,32. Como consequência, muitos protocolos diferentes de detecção de PCD foram sugeridos, que foram adaptados a combinações particulares de todos esses parâmetros e têm sido usados em vários cenários de aplicação (que vão desde experimentações in vitro sobre pequenos protocolos animais até PCD para uso clínico robusto) para detecção robusta de cavitação e até mesmo para controle retroativo de feedback da pressão11,14,30,31,32,33,34,35. O protocolo PCD empregado no escopo deste estudo é derivado diretamente de McDannold et al.12 e monitora a emissão harmônica para a presença de cavitação estável e ruído de banda larga para detecção inercial de cavitação.
Desenvolvemos um sistema de ME FUS de neuronavigção guiado por imagem para abertura transitória do BBB para aumentar a entrega de drogas no parênquim cerebral. O sistema é baseado em componentes disponíveis comercialmente e pode ser facilmente adaptado a diversas modalidades de imagem diferentes, dependendo das técnicas de imagem disponíveis na instalação animal. Como exigimos um fluxo de trabalho de alto rendimento, optamos por usar raio-X e BLI para orientação de imagem e planejamento de tratamento. As células tumorais transduzidas com uma fotoproteína (por exemplo, luciferase) são adequadas para a imagemBLI 20. Após a administração do substrato de fotoproteína, as células tumorais podem ser monitoradas in vivo e o crescimento e localização do tumor podem ser determinados20,36. A BLI é uma modalidade de imagem de baixo custo, permite acompanhar o crescimento do tumor ao longo do tempo, tem tempos de varredura rápidos e se correlaciona bem com o crescimento do tumor medido com ressonância magnética36,37. Optamos por substituir o banho de água por um cone cheio de água ligado ao transdutor para permitir flexibilidade para mover livremente a plataforma em que o roedor é montado8,24. O design é baseado em uma plataforma destacável equipada com integração de (I) marcadores fiduciais de plataforma estereustática (II) de pequena animal com máscara de compatibilidade de imagem x e óptica (III) de alta destastésia rápida e (IV) sistema de aquecimento animal regulado pela temperatura integrada. Após a indução inicial da anestesia, o animal é montado em uma posição precisa na plataforma onde permanece durante todo o procedimento. Consequentemente, toda a plataforma passa por todas as estações do fluxo de trabalho de toda a intervenção, mantendo um posicionamento preciso e reprodutível e anestesia sustentada. O software de controle permite a detecção automática dos marcadores fiduciais e registra automaticamente todos os tipos de imagens e modalidades de imagem (ou seja, micro-CT, raio-X, BLI e imagem de fluorescência) no quadro de referência da plataforma estereotática. Com a ajuda de um procedimento de calibração automática, a distância focal do transdutor de ultrassom é precisamente conhecida dentro, o que permite a fusão automática do planejamento intervencionista, entrega acústica e análise de imagem de acompanhamento. Como mostrado na Figura 1 e Figura 2,esta configuração fornece um alto grau de flexibilidade para projetar fluxos de trabalho experimentais dedicados e permite o manuseio intercalado do animal em diferentes estações, o que, por sua vez, facilita experimentos de alto rendimento. Usamos esta técnica para a entrega bem sucedida de drogas em xenoenxertos de rato de glioma de alto grau, como glioma midline difuso.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL luer-lock syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309628</td>
			<td>Plastipak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>Terumo Agani</td>
			<td>8AN1938R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Terumo Agani</td>
			<td>8AN2316R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Transpore surgical tape</td>
			<td>Science applied to life</td>
			<td>7000032707</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary waveform generator</td>
			<td>Siglent</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated stereotact</td>
			<td>in-house built</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Stereotact with all elements were in-house built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker In-Vivo Xtreme</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Includes software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered NaCl solution</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG</td>
			<td>220/12257974/110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorfine hydrochloride</td>
			<td>Indivior UK limitd</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>0.324 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage enrichment: paper-pulp smart home</td>
			<td>Bio services</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon filter</td>
			<td>Bickford</td>
			<td>NC0111395</td>
			<td>Omnicon f/air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic spoon</td>
			<td>n.a</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, potassium salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VUmc pharmacy</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fresenius NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>NaCl 0.9 %, 1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl</td>
			<td>Braun Surgical</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Histoacryl 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>324825/324826</td>
			<td>0.5 mL and 0.3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>TEVA Pharmachemie BV</td>
			<td>8711218013196</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Alfasan</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>10 %, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>2918-11416M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoflon catheter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>391349</td>
			<td>26 GA 0.6 x 19 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Keysight technologies</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>InfiniiVision DSOX024A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation Ltd</td>
			<td>210L</td>
			<td>Model 210L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preamplifier DC Coupler</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n..</td>
			<td>Serial number: DCPS94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sedazine</td>
			<td>AST Farma</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SonoVue microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>8 &#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>various syringes can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Indivior UK limitd</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>0.3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>1 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4142-1EA</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>01-02</td>
			<td>Aquasonic 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic gel</td>
			<td>Bausch + Lomb</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput image-guided stereotactic neuronavigation and focused ultrasound system for blood-brain barrier opening in rodents

A barreira hemencefálica (BBB) tem sido um grande obstáculo para o tratamento de várias doenças cerebrais. As células endoteliais, conectadas por junções apertadas, formam uma barreira fisiológica impedindo que grandes moléculas (>500 Da) entrem no tecido cerebral. O ultrassom focado (FUS) mediado por microbolhas pode ser usado para induzir uma abertura de BBB local transitória, permitindo que drogas maiores entrem no parenchyma cerebral.
Além de dispositivos clínicos em larga escala para tradução clínica, a pesquisa pré-clínica para avaliação de resposta terapêutica de candidatos a medicamentos requer configurações dedicadas de ultrassom animal para abertura de BBB direcionada. De preferência, esses sistemas permitem fluxos de trabalho de alto rendimento com alta precisão espacial, bem como monitoramento integrado de cavitação, enquanto ainda são econômicos tanto no investimento inicial quanto nos custos de execução.
Aqui, apresentamos um sistema de FUS ANIMAL de pequeno animal bioluminescência e raios-X guiado que se baseia em componentes disponíveis comercialmente e preenche os requisitos acima mencionados. Uma ênfase particular foi colocada em um alto grau de automação facilitando os desafios tipicamente encontrados em estudos de avaliação de medicamentos pré-clínicos de alto volume. Exemplos desses desafios são a necessidade de padronização para garantir a reprodutibilidade de dados, reduzir a variabilidade intra-grupo, reduzir o tamanho da amostra e, assim, cumprir com os requisitos éticos e diminuir a carga de trabalho desnecessária. O sistema BBB proposto foi validado no âmbito da abertura do BBB facilitou testes de entrega de medicamentos em modelos de xenoenxerto derivados do paciente de glioblastoma multiforme e glioma médio difuso.

O sistema fus descrito (Figura 1 e Figura 2) e o fluxo de trabalho associado têm sido usados em mais de 100 animais e produziram dados reprodutíveis em camundongos saudáveis e tumores. Com base na cavitação registrada e na densidade espectral nos harmônicos no momento de pico da injeção de bolus de microbolhas, o poder espectral de cada frequência pode ser calculado utilizando-se a análise de Fourier, conforme explicado na etapa 4 do Protocolo. Com bas...

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A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

A barreira hemencefálica (BBB) pode ser temporariamente interrompida com ultrassom focado (ME) mediado por microbolhas. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para abertura BBB de alto rendimento in vivo usando um sistema de FUS modular acessível para especialistas em não-ultrassom.

Um sistema de neuronação estereática guiada por imagem de alta produtividade e sistema de ultrassom focado para abertura de barreira hemencefálica em roedores

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

a-high-throughput-image-guided-stereotactic-neuronavigation-focused

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.6K visualizações.  Cancer Center Amsterdam. A barreira hemencefálica (BBB) pode ser temporariamente interrompida com ultrassom focado (ME) mediado por microbolhas. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para abertura BBB de alto rendimento in vivo usando um sistema de FUS modular acessível para especialistas em não-ultrassom.

Vídeo: A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Neurociência

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

Avaliação da permeabilidade da barreira hemato - encefálica por infusão intravenosa de albumina FITC-etiquetadas em um modelo do rato da doença neurodegenerativa

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

Uma abordagem benchtop para a abertura da barreira cerebral de sangue específica do local usando ultrassom focado em um modelo de rato

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly useful for disorders in which identifiable neuronal circuitry plays a key role, such as epilepsy and movement disorders. Currently available surgical modalities, while effective, generally involve an invasive surgical procedure, which can result in surgical injury to non-target tissues. Consequently, it would be of value to expand the range of surgical approaches to include a technique that is both non-invasive and neurotoxic.
Here, a method is presented for producing focal, neuronal lesions in the brain in a non-invasive manner. This approach utilizes low-intensity focused ultrasound together with intravenous microbubbles to transiently and focally open the Blood Brain Barrier (BBB). The period of transient BBB opening is then exploited to focally deliver a systemically administered neurotoxin to a targeted brain area. The neurotoxin quinolinic acid (QA) is normally BBB-impermeable, and is well-tolerated when administered intraperitoneally or intravenously. However, when QA gains direct access to brain tissue, it is toxic to the neurons. This method has been used in rats and mice to target specific brain regions. Immediately after MRgFUS, successful opening of the BBB is confirmed using contrast enhanced T1-weighted imaging. After the procedure, T2 imaging shows injury restricted to the targeted area of the brain and the loss of neurons in the targeted area can be confirmed post-mortem utilizing histological techniques. Notably, animals injected with saline rather than QA do demonstrate opening of the BBB, but dot not exhibit injury or neuronal loss. This method, termed Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) could provide a non-invasive approach for treating neurological disorders associated with disturbances in neural circuitry.

The goal of the protocol is to provide a method for producing non-invasive neuronal lesions in the brain. The method utilizes Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) to open the Blood Brain Barrier in a transient and focal manner, in order to deliver a circulating neurotoxin to the brain parenchyma.

Lesão Neuronal Direcionada para a Desconexão Não Invasiva do Circuito Cerebral

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Abertura da Barreira Hematoencefálica Induzida por Ultrassom Focalizado para Atingir Estruturas Cerebrais e Avaliar a Neuromodulação Quimiogenética

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Um modelo 3D de barreira hematoencefálica derivado de células-tronco pluripotentes humanas

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

Autor em destaque: uma abordagem personalizada para investigar a doença de Alzheimer usando um modelo de barreira hematoencefálica in vitro 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...