Ce protocole montre visuellement comment établir un système de culture fiable à long terme pour le tunicate pélagique marin Oikopleura dioica. Le système de culture Oikopleura fournit les ressources de base pour étudier un large éventail de domaines biologiques liés à l’écologie, au développement, à la génomique et à l’évolution. Cette espèce a un cycle de vie court, une fécondité élevée, et elle peut être facilement récoltée sur le rivage, ce qui en fait un excellent organisme modèle.
Bien que ce protocole soit optimisé pour O.dioica, nous espérons qu’il pourra être appliqué à d’autres organismes planctoniques. Pour commencer, initier des algues pour soutenir la culture Oikopleura, en commençant par l’autoclaving l’eau de mer filtrée. Pour initier une culture de stock de Chaetoceros calcitrans, 60 mils d’eau de mer autoclavée ont été complétés par les microlitres suivants: 30 microlitres de vitamines, 30 microlitres de solution A, 15 microlitres de silicate de sodium, et 60 microlitres de streptomycine.
Enfin, 30 microlitres de C.calcitrans provenant d’une culture boursière antérieure ont été ajoutés en tant qu’inoculant. Reportez-vous au tableau deux du manuscrit concernant les volumes de suppléments et d’inoculation pour les autres espèces d’algues et les types de culture. Après l’inoculation, le stock et les sous-cultures sont maintenus dans un incubateur à 17 degrés Celsius avec un éclairage continu.
Après environ 10 jours, la croissance des algues est confirmée par les flacons devenant colorés. Lorsque cela se produit, déplacez les cultures de stock vers le stockage à long terme à quatre degrés Celsius pendant un mois tout en maintenant la sous-culture dans le même incubateur. Pour créer une culture de travail, ajouter les suppléments nécessaires à 400 mils d’eau de mer autoclavée et inoculer avec 100 mils de la sous-culture précédente.
Scellez le flacon avec un bouchon en caoutchouc, insérez une pipette jetable d’un mil, et déplacez-les à une station d’algues et maintenez-les à température ambiante avec une photopériode de huit heures et une aération constante. Faites tourbillonner manuellement les cultures d’algues deux fois par jour pour empêcher l’agrégation au fond du flacon. Une fois que les cultures d’algues ont été établies, prélever des échantillons sur le terrain sur un site local.
Jetez un filet de plancton et laissez l’extrémité de la morue couler d’un à deux mètres sous la surface. Remorquer le filet à une vitesse d’environ 5 à un mètre par seconde. Continuer le remorquage d’avant en arrière pendant deux à cinq minutes.
Le temps de remorquage doit être ajusté en fonction de l’abondance du plancton sur place. Après le remorquage, soulevez soigneusement le filet et transférez lentement le contenu de l’extrémité de la morue à une bouteille en verre de 500 mil. Remplissez la bouteille sur la jante pour éviter les bulles d’air qui pourraient causer du stress aux animaux pendant le transport.
À ce stade, la présence d’Oikopleura peut être confirmée en regardant les bouteilles d’échantillon sur un fond sombre. Toutefois, une observation microscopique est nécessaire pour l’identification au niveau des espèces. Répétez ce processus jusqu’à ce que trois bouteilles de 500 mil aient été collectées.
Recueillir l’eau de mer de surface pour enregistrer la salinité, la température et la concentration de chlorophylle à l’moyen d’un profileur CTD. De plus, recueillir de 10 à 15 litres d’eau de mer sur place pour aider à acclimater les animaux aux conditions de laboratoire. Pour acclimater les animaux, préparez un rapport un pour un de l’eau de mer de surface du site de l’échantillon et de l’eau de mer filtrée maintenue en laboratoire.
Le volume final doit être ajusté entre cinq et 10 litres, selon la concentration de l’échantillon de plancton. Ajouter délicatement l’échantillon de 500 mil au bécher préparé. À l’aide d’une pagaie fixée à un moteur synchrone tournant à 15 RPM, gardez le plancton en suspension pendant la nuit.
Le lendemain matin, vérifiez la présence d’Oikopleura à l’œil nu. Transférez les animaux dans une boîte de Pétri et observez-les au microscope à champ foncé réglé entre 20 et 40 fois pour une identification positive. Oikopleura sont caractérisés comme des animaux en forme de têtard ondulant leur queue à l’intérieur d’une maison translucide.
Pour confirmer O.dioica, recherchez des mâles matures avec des 90 ou des femelles jaunes avec des œufs. Si les animaux sont immatures, recherchez la présence de deux cellules subchordales à la moitié distale de la queue. Ceux-ci sont présents chez les animaux matures et immatures.
Une fois que l’espèce est confirmée, transférez-les dans une nouvelle boîte de Pétri. Répétez ce processus jusqu’à ce que 10 à 20 individus aient été confirmés au niveau des espèces. Si aucun O.dioica n’est trouvé, gardez le bécher en remuant pendant un jour ou deux de plus.
Les petits O.dioica qui n’étaient pas observables au départ continueront de croître et de devenir plus faciles à voir. Si aucun n’apparaît après une semaine, jetez l’échantillon et essayez à nouveau l’échantillonnage. Afin d’établir une monoculture, isoler 120 O.dioica d’un échantillon de champ dans cinq litres d’eau de mer filtrée.
Le lendemain matin, recherchez des mâles matures identifiés par les 9es jaunes et des femelles avec des œufs qui apparaissent comme des sphères chatoyantes et dorées. Préparer un bécher reproducteur en transférant doucement 15 mâles et 30 femelles avec une pipette à oisons de cinq mil à un bécher contenant 2,5 litres d’eau de mer filtrée. Pour minimiser le stress physique pendant le transfert manuel, relâchez lentement les animaux sous la surface de la nouvelle eau de mer.
Permettre aux adultes isolés de frayer naturellement. Après le frai, une fécondation réussie peut être confirmée en extrayant de cinq à 10 mils d’eau de mer du fond du bécher reproducteur et en identifiant les œufs avec des clivages au microscope. Le premier matin après le frai, le premier jour, une nouvelle génération de jeunes animaux avec des maisons gonflées devrait apparaître dans le bécher.
Utilisez un bécher portatif de 500 mil pour transférer délicatement les animaux dans un nouveau bécher contenant 7,5 litres d’eau de mer fraîche filtrée. Versez lentement le contenu à la surface pour minimiser les turbulences et les forces de cisaillement. Le deuxième matin suivant le frai, deuxième jour, transférez manuellement 150 animaux à un nouveau bécher contenant cinq litres d’eau de mer fraîche filtrée.
Le troisième matin après le frai, troisième jour, transférez manuellement 120 animaux dans un nouveau bécher avec cinq litres d’eau de mer fraîche et filtrée. Au quatrième jour, les animaux adultes sexuellement matures devraient être présents. Recueillir 15 mâles et 30 femelles pour un nouveau bécher de frai avec 2,5 litres d’eau de mer filtrée pour initier la prochaine génération.
Ce processus est répété et maintenu pour la vie de la culture. Afin de maintenir une monoculture d’O.dioica, les algues alimentaires sont préparées quotidiennement à partir de cultures de travail. Les animaux sont nourris trois fois par jour.
Préparer les aliments quotidiens en mesurant l’absorption de la culture de travail à l’aide d’un spectrophotomètre fixé à 660 nanomètres. Les valeurs d’absorption, les volumes de culture o.dioica cibles et la maturité animale sont placés dans une feuille de calcul préparée basée sur une courbe de croissance des algues précédemment déterminée pour calculer le volume exact d’algues nécessaires à l’alimentation de la journée. Pipette les volumes calculés en tubes de 50 mil, et centrifugeuse à 5000g pendant cinq minutes à température ambiante.
Versez lentement le surnatant, et pipette soigneusement de haut en bas pour résuspendre les algues granulées. Remplissez les tubes de leur volume d’origine avec de l’eau de mer fraîche et filtrée. D’après le tableau quotidien de l’alimentation des algues de la feuille de calcul, alimentez la quantité spécifiée à chaque bécher à 9 .m.
12 .m et 17 .m. Une pompe de dosage automatisée peut être réglée pour nourrir les animaux à 17 .m.
le week-end sans la présence d’un personnel de culte. Après chaque alimentation, maintenez les algues préparées à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être utilisées pour l’aliment suivant. O.dioica peut être recueilli dans un port par le remorquage en douceur d’un filet de plancton modifié équipé d’un maillage de 100 microns et d’une extrémité de morue non filtrante.
L’échantillonnage effectué entre 2015 et 2019 a montré des variations saisonnières de la présence d’O.dioica dans les ports d’Okinawa. La température de l’eau de mer de surface semblait influencer la présence des animaux. O.dioica dominait lorsque la température de l’eau de mer de surface était de 28 degrés ou plus.
O.dioica a coexisté avec Oikopleura longicauda à des températures comprises entre 24 et 27 degrés. Cependant, O.longicauda a dominé à des températures inférieures à 23 degrés. Les changements de salinité n’étaient pas corrélés avec l’abondance d’O.dioica.
Les trois facteurs les plus importants pour établir des systèmes de culture O.dioica stables sont le maintien d’une haute qualité de l’eau avec un système de filtration en plusieurs étapes, l’identification d’un régime alimentaire optimal, de préférence par la création de courbes standard des algues, et la préparation de beakers reproducteurs avec un nombre suffisant de mâles et de femelles. Suivant le protocole fourni, le cycle de vie d’O.dioica est de quatre jours à 23 degrés. Nous avons établi de façon fiable six populations indépendantes d’O.dioica, qui ont toutes duré plus de 20 générations.
En conclusion, l’établissement d’une culture stable de l’O.dioica peut se faire rapidement et de manière rentable. Avec une configuration appropriée, une culture stable peut être réalisée en une semaine. En conjonction avec son petit génome et son cycle de vie rapide, O.dioica est ainsi une puissante espèce modèle d’chordate.
O.dioica peut être maintenu dans l’eau de mer artificielle et naturelle. Le stockage à long terme des aliments algales est possible en utilisant la culture solide et la cryopréservation. En outre, le sperme d’O.dioica peut également être cryopréservé et rester viable pendant plus d’un an.
O.dioica continue de fournir des informations puissantes sur divers domaines biologiques. Une compréhension de la saisonnalité locale, un système culturel méticuleux et quelques individus dévoués permettent d’établir une culture efficace avec peu d’efforts.
