Ce protocole est utilisé pour étudier quantitativement l’assemblage et la structure des segments initiaux axonaux des neurones de l’hippocampe qui manquent d’AIS pré-assemblé en raison de l’absence d’une ankyrine-G géante. Pour commencer, disséquer six à huit hippocampes de bébés postnatals d’un jour avec du milieu HBSS dans une boîte de Pétri. Hachez l’hippocampe avec des ciseaux de dissection en petits morceaux et transférez-les du plat dans un tube de 15 millilitres.
Lavez les hippocampes deux fois avec cinq millilitres de HBSS, et laissez-les dans 4,5 millilitres de HBSS après le lavage. Ajouter 0,5 millilitres de trypsine à 2,5 % dans 4,5 millilitres de HBSS et incuber dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, en inversant le tube toutes les cinq minutes. Les hippocampes bien digérés devraient devenir collants et former un cluster.
Si nécessaire, prolongez la digestion pendant cinq minutes supplémentaires. Laver l’hippocampe avec hbss trois fois pendant cinq minutes par lavage. Après le lavage, ajoutez deux millilitres de HBSS et pipettez l’hippocampe de haut en bas avec une pipette Pasteur 15 fois.
Triturer le tissu avec une pipette Pasteur polie au feu 10 fois, et reposer le tube pendant cinq minutes jusqu’à ce que tous les morceaux soient réglés au fond. Répétez la trituration avec les morceaux restants jusqu’à ce que la plupart d’entre eux aient disparu. Ensuite, utilisez une pointe de pipette d’un millilitre pour transférer doucement le surnageant contenant les neurones dissociés dans des plats de placage.
Ajoutez-le directement au placage pré-incobé et secouez doucement la plaque. Deux à quatre heures après l’ensemencement, vérifiez les plats de placage avec un microscope optique. La majorité des neurones devraient avoir attaché à la glissade de couverture.
À l’aide d’une pince à pointe fine, retournez le couvercle glisse vers les plats d’alimentation des cellules gliales contenant un milieu de culture neuronale préconditionné avec les points de cire orientés vers le bas. Les neurones peuvent se développer dans les plats d’alimentation des cellules gliales jusqu’à un mois. Nourrissez les neurones tous les sept jours avec un millilitre de milieu de culture neuronale frais.
Le troisième jour in vitro, retournez les glissades de couverture avec le côté du point de cire tourné vers le haut dans un plat d’alimentation de cellules gliales avec un milieu de culture neuronale conditionné. Mélanger 0,25 microgramme d’ADN CRE BFP avec 0,5 microgramme d’ADN ankyrine-GFP dans un tube de 1,7 millilitre pour transfecter quatre glissades de couverture. Ajouter 100 microlitres optimales.
Ensuite, mélangez le tube et reposez-vous sur un rack. Si seul le BFP CRE est transfecté, le squelette plasmique GFP est utilisé pour correspondre à la quantité totale d’ADN. Mélanger trois microlitres de réactif de transfection avec 100 microlitres d’optimum dans un nouveau tube de 1,7 millilitre et incuber le tube pendant cinq minutes à température ambiante.
Ensuite, mélangez 100 microlitres de l’ADN précédemment mélangé avec 100 microlitres de mélange de réactif de transfection, et laissez-le pendant cinq à 10 minutes sur un rack. Ajoutez 50 microlitres du mélange d’ADN sur le dessus de chaque glissement de couverture en insérant la pointe juste en dessous du support sans toucher les glissements de couverture. Pipette lentement pour éviter de répandre le mélange d’ADN.
Ramenez lentement le plat à l’incubateur et laissez-le là pendant 30 à 45 minutes. Retournez le couvercle glisse vers le plat d’alimentation glial à la maison avec le côté du point de cire vers le bas et remettez le plat dans l’incubateur. Pour la quantification AIS, ouvrez les images de la série Z aux Fidji et générez une projection maximale d’images.
Après avoir soustrait le signal d’arrière-plan de glissement de couverture vide de l’image, tracez une ligne le long de l’AIS, en vous assurant que la largeur de la ligne couvre entièrement l’AIS. Commencez la ligne avant que le signal AIS soit soulevé au-dessus de l’arrière-plan et arrêtez après qu’il tombe à l’arrière-plan. Mesurez l’intensité moyenne des pixels le long de la ligne et exportez-la vers une feuille de calcul.
Ensuite, exécutez un script MATLAB pour générer la figure finale. L’expérience devrait inclure la transfection de Cre-BFP seulement comme contrôle négatif, la cotransfection de Cre-BFP plus 480 kilodalton ankyrine-G comme contrôle positif, et une condition non-transfectée comme contrôle technique. Dans le contrôle de Cre-BFP seulement, les neurones transfectés manquent de l’accumulation des marqueurs d’AIS, y compris l’ankyrine-G, le bêta spectrin 4, la neurofascine, et les canaux de sodium à tension fermée.
En revanche, Cre et 480 kilodalton ankyrine-G neurones co-transfectés ont entièrement assemblé AIS, ce qui est démontré par la présence de marqueurs AIS. Il est important de confirmer la qualité de la culture par comparaison avec les plats non transfectés. Les neurones malsains ont tendance à montrer une structure anormale de l’AIS, comme l’AIS discontinué ou ectopique.
Pour évaluer comment une mutation neurodevelopmental humaine d’ankyrine-G de désordre affecte l’assemblage d’AIS, l’intensité moyenne d’AIS a été tracée du soma à l’axone distal. Les protéines enrichies par AIS montrent normalement une augmentation rapide du signal de l’axone proximal et une diminution lente du signal à l’axone distal. Lorsqu’elle est alignée avec l’AIS non transfecté, la courbe mutante est plus large et le pic de la courbe est plus bas, ce qui suggère un changement de structure de l’AIS.
L’AIS assemblé de type sauvage ankyrine-G étroitement aligné avec le non-transfecté.
