Les synapses sont les éléments fonctionnels des neurones et leurs défauts ou pertes sont à la base de plusieurs troubles neurodégénératifs et neurologiques. Les études d’imagerie sont largement utilisées pour étudier leur fonction et leur plasticité dans des conditions physiologiques et pathologiques. En raison de leur taille et de leur structure, les études de localisation des protéines nécessitent des techniques d’imagerie à haute résolution.
Dans ce protocole, nous décrivons une procédure pour étudier dans les neurones primaires la co-localisation des protéines cibles avec des marqueurs synaptiques à un niveau de super-résolution à l’aide d’une microscopie d’éclairage structurée. SIM est une technique d’éclairage lumineux à motifs qui double la résolution spatiale de la microscopie à champ large, atteignant un détail d’environ 100 nanomètres. Le protocole indique les contrôles et les paramètres requis pour des études de co-localisation robustes et un aperçu des méthodes statistiques pour analyser correctement les données d’imagerie.
La clé pour permettre l’analyse à un niveau de super-résolution est, cependant, les reagents utilisés lors de l’acquisition, tels que les coverslips chambés et les solutions de montage compatibles avec l’indice de diffraction de l’objectif. Pour obtenir un neurone primaire hippocampal de souris, isolez hippocampe des chiots P1 à P4. Cellules de plaques à 70 000 cellules par puits dans un volume de 200 microlitres par puits.
Attendez que les neurones primaires hippocampaux soient complètement mûris 12 à 14 jours après le placage pour effectuer des études de co-localisation. Ajouter 4% de paraformaldéhyde, PFA, en PBS 200 microlitres par puits aux neurones pour les fixer rapidement. Retirez la solution et incubez les échantillons avec de l’albumine sérique bovine à 1 %, BSA, en PBS à 200 microlitres par puits pendant une heure à température ambiante pour couvrir passivement toutes les surfaces de liaison libre de la plaque avec une protéine non pertinente pour l’analyse.
Un tampon de blocage basé sur BSA sans Triton X-100 réduit l’arrière-plan de l’anticorps plus efficacement que le même tampon avec 0,2%Triton X-100. Ajouter l’anticorps primaire. Comme un contrôle négatif, n’ajoutez aucun anticorps primaire à l’un des puits.
Cellules de montage à l’aide d’un support compatible SIM, par exemple ProLong Glass Antifade Mountant. Couvrir et protéger les cellules avec un verre de couverture, par exemple, une couverture ronde d’un diamètre de huit millimètres.
Les carrés peuvent également être utilisés. Rangez les couvre-couvertures chambés à température ambiante et attendez au moins 48 heures avant d’acquérir des images. Le verre diamant nécessite au moins deux jours de séchage avant les acquisitions à super résolution.
Utilisez deux stratégies pour assurer la spécificité des anticorps. Le premier est l’utilisation d’au moins deux anticorps différents ciblant le même substrat. La deuxième stratégie est la neutralisation des anticorps par incubation avec la cible protéique purifiée, ou l’utilisé pour soulever l’anticorps.
Nous utilisons régulièrement un microscope à super résolution N-SIM fabriqué par Nikon pour notre analyse. Les instructions qui suivent doivent être destinées à l’acquisition d’images SIM indépendamment du microscope d’utilisation. Il est également important de maximiser les performances du microscope pour effectuer un étalonnage précis des instruments, y compris l’anneau de correction, l’alignement laser et la focalisation du bloc de grille.
Avant l’acquisition d’images SIM, le système nécessite un étalonnage approprié avec des perles fluorescentes de taille sous-résolution spécifiques. Un exemple sont les microsphères TetraSpeck. Ces perles sont tachées de différents colorants fluorescents pour permettre l’étalonnage de différents lasers avec un échantillon.
Dans un bain d’eau, sonicate environ 1,8 fois 10 à la 8e microsphère fluorescente pendant 10 minutes. Diluer les microsphères fluorescents un sur 500 dans de l’eau distillée double. Sonicate une deuxième fois pendant 10 minutes supplémentaires.
Pipette 15 microlitres des perles diluées dans un puits d’un coverslip chambé. Laissez sécher la solution pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter 10 microlitres de la solution de montage, par exemple
ProLong Glass, et placer un coverslip de huit millimètres sur le dessus. Attendez au moins 48 heures pour permettre un traitement approprié. Allumez le microscope et les lasers.
Laissez le système se réchauffer pour atteindre l’équilibre thermique de tous les composants du microscope et le système de microscope sim super-résolution nécessite au moins trois heures. Sélectionnez l’objectif 100X. Démarrez l’étalonnage en alignant les lasers au centre du bloc de râpage de diffraction.
Dans le système N-SIM, un bouton de micromètre et une caméra dédiée permettent de centrer les faisceaux lumineux vers la cible. Insérez le coverslip chambé du microscope pour la visualisation. Réglez le système à l’épaisseur du coverslip chambé en ajustant le couvercle de correction objectif.
NIS Software, le logiciel propriétaire fourni avec des systèmes de microscope à super résolution N-SIM, a une fonction automatique pour réguler la correction des couleurs. Ajustez la mise au point du bloc de râpage pour chaque canal afin d’assurer un éclairage structuré ciblé du motif sur l’échantillon. Le logiciel fournit une fonction automatique pour cette tâche.
Acquérir des images SIM 3D brutes des microsphériques multicolores. Calculez pour chaque longueur d’onde séparée la transformation Fourier de l’image super-résolue. Si l’image transformée n’obtient pas un motif floral correct, redémarrez l’étalonnage puisque la super-résolution n’a pas été atteinte.
Dans l’image super-résolue, sélectionnez une seule microsphère et calculez son profil d’intensité pour chaque canal afin de mesurer la résolution obtenue. Il devrait maintenant être proche de 100 nanomètres latéralement. Effectuez l’enregistrement des canaux en superposant une acquisition multicanal des microsphériques.
L’objectif est de collimate tous les signaux de canal latéralement et axially. Cela permettra d’éliminer les aberrations chromatiques dues au désalignement des différents canaux et d’aider à l’analyse de co-localisation. Confirmez la qualité de l’étalonnage en utilisant l’étape de phase d’éclairage des fonctions et la mise au point à motifs d’éclairage de SIMcheck, une suite de plugins pour l’application open source ImageJ.
Commencez à analyser l’échantillon à l’aide d’un objectif 40X en mode confoccal ou champ large. Cela permet la navigation de l’échantillon, le maintien de bons détails et un grand champ de vision. Utilisez le signal d’anticorps MAP2 pour détecter une zone représentant les processus neuronaux.
Obtenez des images de l’échantillon en mode confoccal pour déterminer la qualité de la coloration. Passez à l’objectif 100X. Appliquer de l’huile sur l’objectif 100X.
Acquérir une image large ou confoccale qui sera utilisée plus tard pour évaluer la qualité de l’image super-résolue. Passez en mode SIM 3D. À l’aide de fenêtres de dialogue pour définir les paramètres d’acquisition, sélectionnez le réglage de profondeur de bit le plus élevé disponible pour maximiser l’information sur les couleurs.
Typiquement, 16 bits est le choix standard. De plus, pour améliorer le rapport signal-bruit, choisissez une valeur d’acquisition à basse fréquence, comme un mégahertz. À l’aide de fenêtres d’histogramme, réglez la puissance laser pour obtenir une réponse linéaire du signal pour éviter la perte d’informations, limitez les pixels saturés dans les images.
Le système N-SIM utilise une caméra Andor iXon3. Lorsque vous travaillez à 16 bits, choisissez une intensité cible de 16 000 pour assurer la réponse linéaire de la caméra. Sinon, choisissez une fourchette comprise entre 30 000 et 45 000 pour maximiser la gamme dynamique des acquisitions.
Réglez la puissance laser entre 0,1% et 50% lors de l’imagerie des échantillons et les temps d’exposition entre 50 millisecondes et deux secondes. Les puissances laser supérieures à 50% peuvent provoquer un photobleaching rapide des fluorophores utilisés. Commencez à acquérir les images en mode SIM 3D.
Utilisez SIMcheck, une suite de plugins gratuits pour ImageJ, pour évaluer la qualité des acquisitions des images brutes. Si SIMcheck ne détecte aucun artefact ou problème de qualité, obtenez un minimum de 10 images à partir de répliques techniques complètes pour permettre une analyse statistique. Les images acquises sont des données brutes qui doivent être traitées pour obtenir des images SIM reconstruites qui seront utilisées pour une analyse plus approfondie.
Dans le protocole, nous suggérons d’utiliser la synaptophysine et psd-95 comme marqueurs pré et post synaptiques. Des marqueurs supplémentaires peuvent toutefois être utilisés. Un énorme corps de littérature soutient l’utilisation d’autres protéines, telles que la drebrin et le basson comme marqueurs synaptiques.
Les images 3D sim acquises sont des images brutes qui doivent être traitées pour obtenir des images reconstruites super-résolues. Une reconstruction incorrecte des images brutes peut mener à des artefacts qui affecteraient l’analyse des échantillons. Il convient donc d’accorder une grande attention au bon choix des paramètres de reconstruction.
Traiter les images brutes à l’aide du logiciel d’analyse de reconstruction du microscope pour obtenir une image super-résolue. Alternativement, utilisez un plugin imageJ fairSIM librement disponible pour reconstruire les images brutes. Calculez la transformation fourier des images super-résolues à l’aide du logiciel de reconstruction au microscope ou du plugin ImageJ SIMcheck.
Une bonne image reconstruite doit revenir, pour chaque canal, à une image fleurie. Si les images reconstruites ne parviennent pas à recréer une forme fleurie, redémarrez à partir des images brutes et reconstruisez-les en modifiant les paramètres de reconstruction, tels que le filtrage linéaire, l’apodisation et la suppression de l’ordre zéro. Dans le logiciel NIS utilisant l’aperçu pour surveiller comment la modification des paramètres affecte l’image finale résolue, modifiez le contraste de modulation de l’éclairage du paramètre, la suppression du bruit à haute résolution et la suppression hors foyer.
Analyser l’image reconstruite pour détecter impartialement les artefacts à l’aide de NanoJ-SQUIRREL, un plugin basé sur l’ImageJ, pour évaluer la qualité des images super-résolues. Dans notre analyse de la co-localisation, nous avons utilisé deux approches. La première est une approche visuelle basée sur l’analyse de profil qui montre des événements simples de co-localisation et qui identifie la contribution de chaque canal.
Dans un premier temps, pour étudier la co-localisation entre les marqueurs synaptiques et une protéine d’intérêt, prenez une image super-résolue et analysez un seul locus pour déterminer le chevauchement du signal. Identifiez un seul locus sur l’image super-résolue. Obtenez les profils d’intensité des signaux fluorescents au lieu d’intérêt.
Si l’analyse de profil a suggéré une co-localisation unique du locus, une analyse plus générale de l’ensemble de l’image peut être effectuée en calculant les coefficients de Pearson et mander. Utilisez JACoP, un plugin ImageJ, pour déterminer deux paramètres de co-localisation, pearson et mander. Après avoir calibré le système et évalué la qualité des images reconstruites, nous avons ensuite commencé à analyser les cultures neuronales primaires tachées d’un anticorps contre MAP2, un marqueur neuronal, PSD-95, un marqueur postsynaptique, et notre protéine cible SUMO1.
Nous avons d’abord analysé l’échantillon effectuant la microscopie confoccale à quatre canaux avec un objectif de 40X. Lors de la sélection d’une zone représentant les processus neuronaux, nous sommes passés à un objectif 100X. Nous avons acquis des images confoccales et SIM d’une même zone afin d’évaluer la qualité de la reconstruction avec NanoJ-SQUIRREL et d’effectuer une analyse de co-localisation.
L’élucidation de la structure et de la composition de la synapse est cruciale pour la compréhension des processus physiologiques et pathologiques qui régulent la mémoire et la cognition. Alors que dans l’état normal synapses sont les éléments constitutifs de la mémoire, ils sont également à la base de troubles neurologiques complexes, tels que l’une des formes les plus courantes de démence maladie d’Alzheimer. Le protocole décrit ici permet l’étude de la composition protéique des synapses avec une technique de microscopie à super résolution appelée microscopie à éclairage structuré.
