Этот протокол используется для количественного изучения сборки и структуры аксонных начальных сегментов нейронов гиппокампа, которым не хватает предварительно собранной АИС из-за отсутствия гигантского анкирина-G. Для начала рассекайте шесть-восемь гиппокампов от послеродовых, однодневных детенышей со средой HBSS в чашке Петри. Нарежьте гиппокампы ножницами для рассечения на более мелкие кусочки и переложите их из тарелки в 15-миллилитровую трубку.
Дважды вымойте гиппокампы пятью миллилитрами HBSS, а после стирки оставьте их в 4,5 миллилитрах HBSS. Добавьте 0,5 миллилитра 2,5% трипсина в 4,5 миллилитра HBSS и высиживайте на водяной бане 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, переворачивая трубку каждые пять минут. Хорошо переваренные гиппокампы должны стать липкими и образовать скопление.
При необходимости продлите пищеварение еще на пять минут. Мойте гиппокампы HBSS три раза в течение пяти минут за одну стирку. После стирки добавьте два миллилитра HBSS и пипетку гиппокампа вверх и вниз пипеткой Пастера 15 раз.
Тритурировать ткань полированной огнем пипеткой Пастера 10 раз, и уложить трубку в течение пяти минут, пока все куски не улятся на дно. Повторяйте тритурацию с оставшимися кусками, пока большинство из них не исчезнут. Затем используйте наконечник пипетки в один миллилитр, чтобы аккуратно перенести супернатант, содержащий диссоциированные нейроны, на посуду.
Добавьте его непосредственно в предварительно инкубированную гальваническое покрытие и аккуратно встряхните тарелку. Через два-четыре часа после посева проверьте посуду с помощью светового микроскопа. Большинство нейронов должны были прикрепиться к крышке.
Используя тонкий наконечник щипцов, переверните крышку скользящей к посуде глиальных клеток, содержащей предварительно кондиционированную нейрональную культуральную среду с восковыми точками стороной вниз. Нейроны могут расти в глиальных клеточных кормушках до одного месяца. Питают нейроны каждые семь дней одним миллилитром свежей нейрональной питательной среды.
На третий день in vitro переверните крышку, сдвинув восковой точечной стороной вверх в тарелку для подачи глиальных клеток с кондиционированной нейрональной питательной средой. Смешайте 0,25 микрограмма ДНК CRE BFP с 0,5 микрограммами ДНК ankyrin-G GFP в трубке размером 1,7 миллилитра для трансфектации четырех слипов крышки. Добавьте 100 микролитров оптимально.
Затем перемешайте тюбик и полойте на стойку. Если трансфицируется только CRE BFP, плазменная основа GFP используется для сопоставления общего количества ДНК. Смешайте три микролитра трансфекционного реагента со 100 микролитрами оптимального в новой трубке размером 1,7 миллилитра и инкубируйте трубку в течение пяти минут при комнатной температуре.
Затем смешайте 100 микролитров ранее смешанной ДНК со 100 микролитрами смеси трансфекционных реагентов и оставьте ее на пять-10 минут на стойке. Добавьте 50 микролитров смеси ДНК поверх каждого скольжения крышки, вставив наконечник чуть ниже среды, не касаясь слипов крышки. Пипетка медленно, чтобы избежать распространения смеси ДНК.
Медленно принесите блюдо обратно в инкубатор и оставьте его там на 30-45 минут. Переверните крышку обратно к домашней тарелке глиальной кормушки с восковой точкой лицом вниз и положите блюдо обратно в инкубатор. Для количественной оценки АИС откройте изображения серии Z на Фиджи и сгенерируйте максимальную проекцию изображений.
После вычитания из изображения фонового сигнала о скольжении пустой крышки нарисуйте линию вдоль АИС, убедившись, что ширина линии полностью покрывает АИС. Начните линию до того, как сигнал AIS будет поднят над фоном, и остановитесь после того, как он опустится на задний план. Измерьте среднюю интенсивность пикселей вдоль линии и экспортируйте ее в электронную таблицу.
Затем запустите скрипт MATLAB, чтобы сгенерировать окончательную цифру. Эксперимент должен включать только трансфекцию Cre-BFP в качестве отрицательного контроля, Cre-BFP плюс котрансфекцию анкирина-G 480 килодалтонов в качестве положительного контроля и нетрансфектное состояние в качестве контроля техники. В контроле только Cre-BFP трансфектным нейронам не хватает накопления маркеров АИС, включая анкирин-G, бета-4 спектрин, нейрофасцин и натриевые каналы с напряжением.
Напротив, ко-трансфефицированные нейроны Cre и 480 килодалтонов анкирин-G имеют полностью собранную АИС, что демонстрируется наличием маркеров АИС. Важно подтвердить качество культуры путем сравнения с неперераженными блюдами. Нездоровые нейроны, как правило, демонстрируют аномальную структуру АИС, такую как прекращенная или эктопическая АИС.
Чтобы оценить, как мутация расстройства нервного развития человека анкирин-G влияет на сборку АИС, средняя интенсивность АИС была построена на графике от сомы до дистального аксона. Белки, обогащенные АИС, обычно показывают быстрое увеличение сигнала от проксимального аксона и медленное снижение сигнала к дистальным аксону. При выравнивании с неперефраженной АИС мутантная кривая шире, а пик кривой ниже, что предполагает изменение структуры АИС.
Дикий тип анкирин-G собран АИС тесно связан с неперераженным.
