La détection du phytopathogène est une étape cruciale dans la gestion des maladies végétales. Ce protocole fournit une méthode de détection rapide pour la contamination de l’eau d’irrigation due à un agent pathogène commun des chasseurs d’origine hydrique. En utilisant cette technique, des agents pathogènes spécifiques, tels que Phytophthora capcici, peuvent être traités et rapidement détectés à partir de notre grand volume d’eau d’irrigation tout en restant sur place.
Owen Hudson, étudiant à la maîtrise de mon laboratoire, et Sumyya Waliullah, chercheur postdoctoral au laboratoire du Dr Pingxi G, feront la démonstration de la procédure afin de mettre en place une pompe et un filtre pour la détection phytophthora capcici sur place dans l’eau d’irrigation. Fixez un flacon filtrant à un tube relié à une pompe à main et un entonnoir buchner monté dans le bouchon en caoutchouc dans la bouche du flacon filtrant. Ensuite, placez un morceau de papier filtre de taille appropriée avec une taille de rétention de 15 microns dans l’entonnoir.
Pour obtenir des échantillons d’eau recueillir l’eau d’irrigation de la source ciblée. L’eau peut avoir de petites quantités de débris, mais pas de sédiments ou de sol importants. Versez lentement entre 50 et 1000 millilitres d’eau d’essai sur le papier filtre à l’intérieur de l’entonnoir tout en utilisant la pompe à main pour créer une aspiration pour tirer l’eau à travers l’entonnoir.
Lorsque toute l’eau a été filtrée, utilisez des forceps pour enlever le papier filtre de l’entonnoir. Et utilisez des ciseaux stériles pour couper le papier en petits morceaux. Submergez de huit à 12 morceaux de papier dans 400 microlitres de tampon d’extraction dans un tube de 1,5 millilitre pendant une incubation de cinq minutes à température ambiante.
Vortex ou agiter le papier pendant 10 secondes une fois par minute. À la fin de l’incubation, utiliser des forceps pour enlever le papier avec le moins de tampon possible. Et répétez la licence avec la prochaine série de morceaux de papier filtre.
Pour l’extraction de l’ADN à partir des échantillons de papier filtre ajouté 20 microlitres de proteinase K et 10 microlitres de 10 nanogrammes par microlitre ARN à l’échantillon aussi et incuber la solution à température ambiante pendant 15 minutes avec vortex ou secouant toutes les trois minutes. À la fin de l’incubation, ajouter 500 microlitres de perles magnétiques dans un tampon liant à l’échantillon et bien mélanger en secouant. Après cinq minutes à température ambiante, placer le tube et la grille du séparateur magnétique pendant deux minutes avant d’enlever et de jeter le supernatant.
Retirez le tube du séparateur magnétique et suspendez vigoureusement les perles dans 500 microlitres de tampon de lavage. Après 30 secondes, remettre le tube à l’aimant et attendre deux minutes avant de jeter le surnatant. Répétez le lavage avec 500 microlitres de tampon de lavage aussi et 500 microlitres de 80% d’éthanol comme nous venons de le démontrer.
Et l’air conduire la pastille de perles magnétiques pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, suspendre à nouveau les perles dans 50 microlitres de tampon d’élitution avec pipetting pendant une minute avant de remettre le tube sur l’aimant pendant deux minutes pour permettre la collecte du supernatant. Après avoir préparé le mélange d’amorce LAMP tel qu’indiqué dans le tableau, ajouter à 2,5 microlitres d’apprêt mélanger 12,5 microlitres d’un mastermix lamp lave un microlitre d’ADN extrait et neuf microlitres d’eau distillée double à un tube PCR et mettre en place un contrôle positif et un contrôle négatif.
incuber tous les échantillons dans un blog de chaleur de 64 degrés Celsius pendant 45 minutes ou le génie trois instrument d’amplification à la fin de l’incubation, une charge de cinq microlitres de chaque échantillon amplifié sur un gel agarose de 1% et l’image des bandes résultantes sur une machine d’imagerie ultraviolette. Si un colorant calorimétrique a été utilisé, visualisez le changement de couleur pour déterminer les résultats comme positifs ou négatifs. Si un instrument portatif d’amplification a été utilisé, consultez le graphique d’amplification à l’écran pour déterminer les résultats.
Le temps optique pour faire fonctionner l’essai LAMP à 64 degrés est de 45 minutes, car les concentrations les plus faibles qui étaient positives pour la détection ne sont pas amplifiées avant 40 minutes, tandis que les concentrations plus élevées sont amplifiées à 20 minutes. L’amplification peut être confirmée sur un gel d’agarose de 1% étiqueté avec une tache d’acide nucléique. Comme illustré PCR conventionnel est 40 fois moins sensible que LAMP.
Détection 4,8 fois 10 à la troisième zoospores par millilitre concentrations au plus bas. Dans cette analyse, des échantillons d’eau ont été prélevés dans sept étangs utilisés pour la production commerciale de légumes dans le comté de Tift, en Géorgie. Trois d’entre nous ont démontré des résultats positifs pour lampadaire.
Cependant, lorsque les échantillons ont été testés par pcr conventionnel, des zoospores ont été détectés dans un seul des trois échantillons positifs. Dans ce tableau, les différences entre les méthodes de détection utilisant des variables telles que la sensibilité, le temps, la préparation requise, les matériaux et le coût sont résumées. LAMP est la méthode la moins chère parmi les méthodes testées, et est également la plus rapide, ne nécessitant que 30 à 60 minutes pour l’amplification par rapport à l’amplification PCR classique.
L’utilisation de cet ADN de protocole extrait des agents pathogènes étroitement liés de graine d’UMI n’a comme résultat aucune détection pour aucun des échantillons, confirmant la spécificité des amorces. Assurez-vous de ne pas verser l’eau de l’échantillon trop rapidement et soyez prudent lorsque vous ajoutez de l’ADN extrait aux tubes LAMP pour limiter la contamination. Une fois que d’autres agents pathogènes d’origine hydrique ont vu leurs ensembles d’amorce spécifiques mis au point, les méthodes de filtration et d’acide de lampe peuvent être adaptées à d’autres agents pathogènes.
