Dans cette particule, nous introduisons une plate-forme de reconstitution in vitro qui imite l’environnement lipidique de la membrane interne des mitochondries. Cette plate-forme peut être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires de la fusion de la membrane interne des mitochondries. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une étude quantitative des protéines membranaires intégrales et des protéines associées à la membrane dans un environnement proche de l’origine.
Pour commencer, mélanger les solutions A et B selon les instructions manuscrites, puis générer le mélange lipidique en ajoutant le volume calculé de la solution de stockage dans des flacons d’ambre avec une seringue en verre. Assortir le volume final en ajoutant du chloroforme supplémentaire dans les flacons. Cuire les glissières au microscope à 520 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Après la cuisson, les refroidir à température ambiante. Ajouter environ 10 grammes d’hydroxyde de sodium à 500 millilitres de méthanol en remuant. Remuer pendant deux heures, en continuant à ajouter de l’hydroxyde de sodium à la solution jusqu’à ce que le précipité commence à se montrer.
Nettoyez les glissières en verre dans une solution de sulfate de dodecyl à 10 %, du méthanol saturé d’hydroxyde de sodium et de l’acide chlorhydrique de 50 millimillires, en se séquentiellement, en sonnant les toboggans sous chaque condition pendant 30 minutes. Nettoyez les glissières en verre dans de l’eau ultrapure pendant 10 minutes entre chaque condition. Conservez le verre de couverture nettoyé scellé dans une solution d’acide chlorhydrique pendant une période d’une période d’au plus deux semaines afin d’assurer une bonne qualité à deux couches.
Nettoyez l’auge en polytétrafluoroéthylène du système de trempage Langmuir-Blodgett à l’aide d’eau chloroforme et ultrapure jusqu’à ce qu’aucun mouillage ne soit observé. Vaporiser le chloroforme sur la surface de l’auge et l’essuyer complètement trois fois avec des lingettes de cellulose, puis rincer trois fois avec de l’eau ultrapure et enlever l’eau par aspiration. Une fois terminé, couvrir la surface de l’auge d’eau ultrapure propre.
Prenez deux morceaux de verre de couverture traités en surface de la solution de nettoyage et rincez-les à l’eau ultrapure pendant environ 30 secondes. Placez le verre de couverture d’une manière dos à dos à l’aide de la pince de substrat pour tenir les glissières en verre. Immergez la glissière de verre sous la surface de l’eau en cliquant manuellement sur la trempette vers le bas sur le système de contrôle Langmuir.
Zéro l’équilibre du film et étendre soigneusement la solution B goutte à goutte à l’interface de l’eau de l’air. Assurez-vous que les lipides ne se propagent qu’à l’interface de l’eau de l’air sans que les gouttelettes de chloroforme et de lipides ne s’enfoncent au fond de la surface du polytétrafluoroéthylène, ce qui créera un canal lipidique et empêchera la formation de monocouches. Arrêtez d’ajouter des lipides lorsque la lecture de l’équilibre du film est d’environ 15 à 20 millinewton par mètre.
Attendez 10 à 15 minutes, puis lancez le contrôleur de barrière pour modifier la surface en cliquant sur démarrer l’expérience. Attendez que la lecture du solde du film augmente à 37 millinewton par mètre et maintenez la pression pendant environ 20 à 30 minutes. Soulevez le verre de couverture à la vitesse de 22 millimètres par minute tout en maintenant la tension de surface à 37 millinewton par mètre.
Un monomère lipidique avec attache polymère sera transféré de l’interface de l’eau de l’air à la surface du verre de couverture par le processus de trempage Blodgett, formant le dépliant inférieur de la bi-couche lipidique. Nettoyez l’interface de l’eau d’air par aspiration et rincez l’auge avec de l’eau ultrapure. Après avoir nettoyé une glissière en verre à un puits avec du chloroforme, de l’éthanol et de l’eau ultrapure, placez-la sur l’auge sous la couche d’eau.
Assurez-vous que le puits est orienté vers l’interface de l’eau de l’air et versez de l’eau fraîche ultrapure jusqu’à ce que la glissière en verre soit entièrement recouverte, puis plongez la glissade de verre sous la surface de l’eau comme décrit précédemment. Tenez le verre de couverture avec le monocouche lipidique à l’aide d’une ventouse en silicium et poussez doucement le monocouche lipidique à l’interface de l’eau de l’air. Maintenez le verre de couverture pendant deux à trois secondes à l’interface, puis poussez-le contre la glissière.
Sortez la glissière avec la couverture. Prenez la couverture et la bicque à un microscope d’épifluorescence et l’image de la bi-couche lipidique selon les directions manuscrites du texte. Préparer un plat de cristallisation contenant de l’eau ultrapure et placer un anneau d’image au microscope propre sous le plat.
Immergez cette glissière et ce verre de couverture qui contiennent la bicposition lipidique sous l’eau. Séparez doucement la glissière et le verre de couverture, en tenant la glissière de verre de couverture du fond et transférez la couverture dans l’anneau d’image. Remplacez l’eau ultrapure dans l’anneau d’image par un tampon de chlorure de sodium bis-tris, en vous assurant que la bicposition lipidique n’est pas exposée à des bulles d’air.
Ajouter 1,1 nanomolaire n-octyl-bêta-glucopyranoside à la bi-couche lipidique, puis ajouter immédiatement le mélange de 1,2 nanomolaire DDM et 1,3 picomoles de L-OPA1 purifié dans l’anneau d’image. Incuber l’échantillon sur un shaker à basse vitesse pendant deux heures. Répartir 30 milligrammes de perles de résine SM-2 en trois millilitres de tampon bis-tris et secouer.
Utilisez une pipette en plastique pour ajouter 5 à 10 microlitres des perles de résine SM-2 à l’anneau d’image et l’incuber pendant 10 minutes, puis rincer les perles de résine. Le volume final du tampon dans l’anneau d’image doit être de 1,5 millilitres. Préparer un milligramme de mélange lipidique A dans la solution chloroforme, puis évaporer le chloroforme sous flux d’azote pendant 20 minutes.
Gardez le mélange sous vide pendant la nuit pour former un film lipidique. Préparez 50 millimilliards de calcium contenant du tampon en dissolvant 15,56 grammes de calcéine en 50 millilitres de solution d’hydroxyde de sodium molaire de 1,5 molaire. Remuer le mélange à température ambiante jusqu’à ce que la calcéine soit complètement dissoute.
Ajouter 12,5 millimolar bis-tris et de l’eau ultrapure pour un volume final de 500 millilitres et ajuster le pH à 7,5. Distribuez le film lipidique dans la calcéine contenant le tampon, puis hydratez entièrement le lipide en chauffant la suspension à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes. Former des liposomes de 200 nanomètres par extrusion à l’aide d’une membrane en polycarbonate.
Ajouter deux microgrammes de L-OPA1 dans 0,5 micromolaire DDM, 2,2 milligrammes liposome et incuber la solution à quatre degrés Celsius pendant 1,5 heures. Retirez le surfactant par dialyse avec une cassette de dialyse de 3,5 kilodaltons contre 250 millilitres de bis-tris de 25 millimlaires, 150 millimolaires de chlorure de sodium et un tampon de calcium de 50 millimlaires à quatre degrés Celsius pendant la nuit, en changeant le tampon deux fois. Retirez la calcéine supplémentaire à l’aide d’une colonne de désaltage PD10, puis procédez à l’imagerie et à l’analyse des données décrites dans le manuscrit du texte.
Des images de microscopie d’épifluorescence d’une bi-couche lipidique et de sa fluidité lipidique sont montrées ici. La distribution lipidique est indiquée avant et après le blanchiment des photos et l’homogénéité est démontrée avant et après la reconstitution. L-OPA1 reconstitué et lipide bi-couche a été validé par spectroscopie de corrélation de fluorescence ou FCS.
Les courbes fcs ont indiqué que 75% de L-OPA1 a été reconstitué dans la bi-couche lipidique suggérant que L-OPA1 diffuse librement dans le polymère attaché bi-couche lipidique avec le potentiel de s’auto-assembler en complexes fonctionnels. Le blanchiment d’étape de fluorescence a indiqué qu’une moyenne de deux à trois copies de L-OPA1 ont été reconstituées dans un liposome donné. La distribution de taille des protéoliposomes reconstitués L-OPA1 a été testée après reconstitution à l’aide de DLS et vérifiée avec FCS.
L’attache membranaire a été surveillée en observant le signal de Texas Red à la surface de la bicture lipidique à l’aide de la microscopie TIRF. Le démifusion ou l’hémifusion de lipide de membrane a été surveillé par Texas Red pendant que le marqueur liposome diffusait dans la bi-couche de lipide. Le désaltérant à la calcéine a permis de distinguer la formation complète des pores de fusion du seul démiage lipidique, permettant une comparaison entre les conditions où les particules stagnent à l’hémifusion et les particules qui procèdent à la fusion complète.
L’attache de membrane a été indiquée par un signal stable de lipide des liposomes et le signal d’effusion n’a comporté aucun désaltérant dans le signal de calcéine, mais une décomposition rapide du signal rouge du Texas a indiqué la diffusion du colorant dans la bi-couche lipidique. La fusion complète a comporté la décomposition de lipide et la libération de contenu. Lorsque vous essayez cette particule, n’oubliez pas de nettoyer soigneusement à la fois le verre de couverture et l’auge Langmuir pour s’assurer que les deux couches de haute qualité sont fabriquées.
Une bonne qualité de l’air est également essentielle pour prévenir les défauts de la bicque. Cette technique nous permet d’explorer de nouvelles questions dans la dynamique et l’organisation des membranes mitochondries. L’expérience future passionnante inclut explorer l’influence de l’assymétrie de bi-couche, du potentiel de membrane, et des mutants maladies-connexes dans la dynamique interne de membrane de mitochondries.
