Ce protocole est important parce qu’il permet aux chercheurs de faire passer les CM-HIPSC commerciales ou fabriquées en interne à un phénotype semblable à celui de l’adulte qui améliore considérablement la valeur prédictive des CM-HiPSC dans le dépistage de la cardiotoxicité. Le principal avantage de ce protocole est qu’il fournit des CM-HiPSC matures dans un format à haut débit pour la cartographie optique du calcium ou du changement de tension. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les mécanismes de la maladie ou pour dépister la cardiotoxicité des médicaments.
Jeffrey Creech, un associé de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par laver les plaques de matrice extracellulaire induisant la maturation, ou MECM, deux fois avec 200 microlitres de solution saline équilibrée de Hank, ou HBSS, 1 heure avant le placage cardiomocytes. Gardez les puits hydratés.
Transférez les tubes cardiomyocytaires du réservoir d’azote liquide à la glace sèche et relâchez la pression en ouvrant légèrement les bouchons du tube. Ensuite, refermez les bouchons du tube et décongelez-les au bain-marie pendant 4 minutes. Après la décongélation des cellules, vaporisez les tubes avec de l’éthanol à 70% avant de les ouvrir.
Transférez les cellules dans des tubes coniques de 15 millilitres avec une pipette de 1 millilitre. Ajouter 1 millilitre de milieu de placage au cryovial et transférer le lavage dans le tube conique de 15 millilitres. Ensuite, égoutter lentement 1 millilitre de milieu de placage et agiter le tube.
Répétez cette opération jusqu’au transfert de 8 millilitres de milieu de placage. Centrifuger le tube de 15 millilitres à 300 x g pendant 5 minutes et remettre la pastille en suspension dans 1 millilitre du milieu de placage. Retirer une partie aliquote, et effectuer le comptage des cellules vivantes avec un hémocytomètre avant d’ajouter un milieu de placage pour obtenir 7,5 x 10 à 5ème cellules par millilitre.
Distribuer 100 microlitres de la suspension cellulaire par puits d’une plaque de 96 puits revêtue de MECM à l’aide d’une pipette multicanal et incuber les cellules pendant 2 jours. Ensuite, remplacez le milieu par 200 microlitres de milieu d’entretien et maintenez les plaques pendant 7 jours, avec un changement de milieu le jour 5. Le jour 7, effectuez le test EP, comme décrit dans le texte.
Assurez-vous de changer le milieu tous les deux jours lorsque vous optez pour l’extension de la culture cellulaire. Pour purifier hiPSC-CM par tri cellulaire activé magnétiquement, ou MACS, aspirez le milieu de culture cellulaire et lavez les cellules avec 1 millilitre de HBSS-Ensuite, dissociez les cellules en ajoutant 1 millilitre de trypsine-éthylènediaminetétraacétique, ou EDTA, et en incubant les cellules pendant 10 minutes. Ensuite, inactivez la trypsine/EDTA en renvoyant et singularisant les cellules avec 2 millilitres de milieu de placage.
À partir des six puits, recueillir les cellules dans un tube conique de 50 millilitres à l’aide d’une crépine de 70 micromètres. Après avoir lavé la passoire avec 3 millilitres de produit de placage, comptez les cellules. Après comptage, centrifuger et laver la pastille de cellule avec 2 millilitres de tampon de séparation MACS glacé avant de granuler et de renvoyer les cellules dans 80 microlitres de tampon de séparation MACS froid par 5 x 10 aux 6ème cellules.
Ajouter 20 microlitres de cocktail froid de déplétion non cardiomyocytaire et mélanger la suspension avant d’incuber sur de la glace pendant 10 minutes. Après avoir lavé les cellules avec 4 millilitres de tampon de séparation MACS froid à 300 x g pendant 5 minutes, remettre la pastille en suspension dans 80 microlitres de tampon de séparation MACS froid. Ajouter 20 microlitres de microbilles froides anti-biotine par 5 x 10 aux 6e cellules, et mélanger délicatement la suspension cellulaire avant d’incuber sur de la glace pendant 10 minutes.
Pendant l’incubation des échantillons, placez les colonnes de déplétion positive équipées des filtres de préséparation de 30 micromètres sur le séparateur MACS et placez les tubes de collecte de 15 millilitres étiquetés sous les colonnes. Ensuite, amorcez chaque colonne avec 3 millilitres de tampon de séparation MACS froid. Mélangez la suspension cellulaire traitée par anticorps avec 2 millilitres de tampon de séparation MACS et ajoutez-la à la colonne.
Ajouter 2 millilitres de tampon de séparation MACS à chaque colonne et recueillir 12 millilitres de suspension de cardiomyocytes à écoulement. Centrifuger les cardiomyocytes et jeter le surnageant avant de remettre les cardiomyocytes en suspension dans un milieu de placage de 1 millilitre. Pour déterminer la concentration, compter les cellules et ajuster le volume à la densité d’ensemencement souhaitée avant de plaquer les cellules cardiomyocytaires purifiées sur les plaques MECM 96 puits.
Aspirer et remplacer le milieu d’entretien des cardiomyocytes par 100 microlitres de colorants sensibles à la tension, ou VSD, ou fluorophores sensibles au calcium, ou LCR, par puits d’une plaque de 96 puits. Après 30 minutes d’incubation, remplacer les colorants par un milieu de dosage ou HBSS. Équilibrez les cellules à 37 degrés Celsius avant d’acquérir une cartographie optique des données de base à l’aide d’un dispositif de cartographie optique à haut débit.
Pour traiter les cellules avec des médicaments pour les tests d’exposition aiguë ou cartographier les cellules exposées de façon chronique à des médicaments d’intérêt, diluer les médicaments dans du diméthylsulfoxyde, ou DMSO, et les stocker sous forme de solutions mères à 20 degrés Celsius avant de les diluer dans HBSS aux concentrations souhaitées. Pour les essais de cardiotoxicité dans des plaques de 96 puits, ajouter quatre doses d’un composé avec au moins huit puits par dose. Utilisez des doses allant de dessous à au-dessus de la concentration plasmatique thérapeutique cliniquement efficace, y compris la dose efficace.
Semblable aux mesures électrophysiologiques de base avant l’application du médicament, capturez les enregistrements électrophysiologiques au moins 30 minutes après le traitement médicamenteux pour les études chroniques. Après les enregistrements de base, appliquer au moins quatre doses de chaque médicament sur les monocouches matures de hiPSC-CMs exprimant GCaMP6m, avec au moins huit puits par dose. Équilibrez les médicaments sur les cellules pendant 30 minutes et réchauffez les cellules à 37 degrés Celsius avant et pendant l’acquisition des données.
Après les enregistrements de base d’une plaque entière, ajouter 500 nanomolaires d’isoprotérénol à chaque puits pour obtenir des données robustes sur la réponse aux médicaments et quantifier les effets de l’isoprotérénol sur la vitesse de battement monocouche, l’amplitude de contraction et la durée transitoire du calcium. Pour acquérir des données de cartographie optique, ouvrez le tiroir avant et positionnez la plaque sur le réchauffeur de plaques. Après avoir ouvert le logiciel d’acquisition et déterminé l’emplacement d’enregistrement du fichier dans le logiciel, sélectionnez la durée de 10 à 30 secondes et la fréquence d’images de l’acquisition pour une résolution temporelle plus élevée, puis cliquez sur Démarrer l’acquisition.
Ouvrez le logiciel d’analyse et, dans l’onglet Filtre d’importation, sélectionnez Rechercher un seul fichier ou Mosaïque multiple pour reconstruire une plaque. Sélectionnez les fichiers et entrez un certain nombre de lignes et de colonnes, puis sélectionnez Automatique. Ensuite, sélectionnez Mettre à jour la taille des pixels, entrez la distance par pixel et utilisez l’assistant de puits pour déterminer l’emplacement des puits dans l’image avant de cliquer sur Enregistrer le processus et de passer à l’onglet suivant.
Ouvrez l’onglet ROIs, ou Regions of Interest, et choisissez de dessiner les ROI manuellement, automatiquement, ou de ne pas utiliser les ROI du tout, qui seront pris en compte pour l’analyse de l’ensemble de la plaque. Après avoir sélectionné la région dans le puits, cliquez sur le bouton Enregistrer le processus pour passer à l’étape suivante. Cochez les cases Masquer les puits et Afficher uniquement les filtres pour visualiser le retour sur investissement.
Ouvrez l’onglet Analyse, sélectionnez chaque puits ou retour sur investissement pour confirmer la précision de la détection automatique des battements. Ajoutez ou supprimez des temps des traces en sélectionnant un temps individuel et en appuyant sur Suppr sur le clavier. Une fois terminé, cliquez sur Enregistrer.
Ensuite, cliquez sur le bouton Time-Space Plot dans l’onglet Analyse et ajoutez la ligne pour déterminer le diagramme spatio-temporel pour visualiser les données de chaque puits ou le retour sur investissement. Après avoir sélectionné une ligne horizontale ou verticale, cliquez sur Générer un tracé. Après avoir assuré la détection précise des battements, passez à l’onglet Exporter et sélectionnez Format de fichier, entrez l’option Statistiques de battement avant de cliquer sur Exporter.
Une fois exportés, ouvrez les fichiers de données et exécutez la routine d’analyse statistique choisie. L’imagerie par contraste de phase a montré que les hiPSC-CM plaqués sur le MECM ont mûri et sont devenus structurellement distincts du même lot de hiPSC-CM replaqués sur l’ECM de la souris. Les cellules matures sont devenues en forme de bâtonnet, tandis que les cellules immatures ont conservé une forme circulaire.
Les cardiomyocytes colorés avec des anticorps alpha-actinine ont montré la forme typique des cellules cultivées sur chaque condition ECM. Conformément à la coloration TnI, la coloration alpha-actinine indiquait que les hiPSC-CMs mûris sur le MECM favorisaient un phénotype mature en forme de bâtonnet et induisaient une plus grande organisation sarcomère. Le contenu et l’activité mitochondriaux étaient distincts entre les cellules cultivées sur l’ECM de souris et le MECM.
Les données électrophysiologiques pour les potentiels d’action enregistrés à l’aide de VSD et du système de cartographie optique ont montré que les cellules spécifiques auriculaires ont un taux de battement spontané significativement plus rapide et une durée de potentiel d’action plus courte, ou APD80, que les cellules spécifiques ventrales. Les cartes thermiques de la plaque entière pour des paramètres tels que APD80 ont révélé la reproductibilité d’un paramètre donné dans une plaque. Les potentiels d’action typiques des monocouches matures de hiPSC-CM ont indiqué la morphologie du potentiel d’action des cardiomyocytes adultes isolés et testés.
Un rythme spontané typique de potentiel d’action a également été affiché. En réponse à l’isoprotérénol, l’activation des récepteurs bêta-1-adrénergiques a provoqué une chronotropie positive, une inotropie positive et une lusitropie positive. La réponse HiPSC-CM au bloqueur de canaux humain lié à l’Ether-a-go-go-go, ou hERG, y compris E-4031, la dompéridone, le vandétanib et le sotalol, a été étudiée en utilisant la fluorescence calcique GCaMP6m pour surveiller le rythme.
L’étude a montré la détection de post-dépolarisations précoces causées par le blocage du canal hERG E-4031. Travaillez rapidement avec les cellules en suspension et évitez les contraintes de cisaillement en pipetant doucement les cellules. De plus, effectuez un changement de support avec précaution pour éviter d’endommager la synchronisation hiPS.
Après cette procédure, les cellules se prêtent à la collecte de protéines, d’ARN, d’ADN et de lipides pour analyse avec la technique préférée des chercheurs. La technique permet aux chercheurs d’étudier les maladies et de tester la cardiotoxicité de nouveaux médicaments utilisant des cardiomyocytes de type adulte.
