Les cardiomyocytes générés par les cellules souches pluripotentes induites ou IPS sont de plus en plus utilisés pour répondre à une variété de questions biologiques dans le domaine de l’électrophysiologie cardiaque. Les principaux avantages de cette technologie sont qu’elle permet une augmentation spectaculaire du débit ainsi que des enregistrements potentiels d’action spécifiques de sous-type dans ventriculaire comme les myocytes, en utilisant un élément promoteur spécifique ventriculaire. L’introduction de capteurs de tension génétiquement codés par transduction lentivirale permet l’imagerie optique des potentiels d’action des cardiomyocytes dérivés des cellules souches pluripotentes d’origine humaine.
Commencez par mélanger le supernatant de culture cellulaire contenant du lentivirus avec le milieu d’entretien des cardiomyocytes, à un rapport un pour un. Ajouter le bromure d’hexadiméthère à une concentration finale de 8 microgrammes par millilitre, pour améliorer l’efficacité de l’infection. Et remplacez le milieu d’entretien des cardiomyocytes dans le plat de culture des cardiomyocytes dérivés des cellules IPS, par le milieu d’infection.
Culture des cardiomyocytes infectés pendant 12 heures à 37 degrés Celsius, et remplacer le milieu d’infection par un milieu frais d’entretien des cardiomyocytes. Avant l’imagerie, échanger le milieu de culture cellulaire avec la solution de Tyrode, complétée par du calcium. Placez ensuite les cardiomyocytes dans une chambre d’imagerie sur la scène d’un microscope inversé d’épifluorescence équipé d’un séparateur d’image.
Si un rythme électrique est nécessaire, installez des électrodes de stimulation dans la chambre d’imagerie et connectez les électrodes à un générateur de stimulus. Mettre les cellules au point, et localiser une cellule exprimant l’indicateur de tension génétiquement codé au centre du champ de visualisation. Réglez la trajectoire optique de sorte que la lumière émise soit acheminer vers le séparant d’image et passez le cube de filtre dans le microscope à celui à combiner avec les filtres dans le séparant d’image.
Dans le logiciel contrôlant la caméra, définissez le paramètre d’acquisition de sorte que l’imagerie à grande vitesse est possible, et configurez le séparant d’image selon les instructions du fabricant. Les deux images représentant les deux bandes de longueur d’onde d’émission différentes doivent être adjacentes l’une à l’autre, chacune occupant la moitié de l’image. Vérifiez et ajustez la mise au point de l’image produite par la caméra au besoin.
Et ajustez la luminosité de la lumière d’éclairage afin d’éviter la saturation des pixels. Réglez l’acquisition de la série de temps, et assombrissez la lumière dans la pièce pour éviter que la lumière parasite n’influence la mesure. Ensuite, ouvrez l’obturateur de lumière excitation et commencer l’acquisition de la série d’images, en commençant le rythme électrique au point de temps approprié, comme expérimentalement approprié.
Lorsque l’acquisition est terminée, fermez l’obturateur lumineux excitation si nécessaire et enregistrez l’enregistrement sur le disque dur. Puis, laissant le paramètre d’enregistrement inchangé, enregistrez l’arrière-plan sur une région du coverslip sans cellules. Pour l’analyse des enregistrements potentiels de la membrane optique, ouvrez la pile de tiff contenant les cellules d’ImageJ et utilisez l’outil de sélection à main libre pour attirer une région d’intérêt sur un cardiomyocyte fluorescent, dans le canal rouge, en prenant soin que la zone soit suffisamment grande pour que la cellule ne sorte pas de la région pendant la contraction.
Ensuite, sélectionnez Analyser, Outils, Gestionnaire de la région d’intérêt et sélectionnez Ajouter T, pour ajouter la région comme région d’intérêt 1. Faites glisser la région d’intérêt sur la même cellule dans le canal vert, et ajoutez cette région comme région d’intérêt 2. Dans les menus Analyser et définir les mesures, désélectionner toutes les options à l’exception de la valeur grise moyenne.
Dans la région du gestionnaire d’intérêt, cliquez sur Plus et Multi Mesure pour sélectionner toutes les tranches et une ligne par tranche options et cliquez sur OK. Une fenêtre s’ouvrira contenant une feuille de calcul avec les trois rangées. Utilisez fichier et enregistrer pour enregistrer la feuille de calcul dans un fichier de valeur séparé de virgule. Fermez la fenêtre avec la pile d’images et la fenêtre de la feuille de calcul sans fermer la fenêtre Region of Interest Manager, et ouvrez la pile de tiff contenant la mesure d’arrière-plan.
Dans la région du gestionnaire d’intérêt, cliquez sur la mesure Plus et Multi pour sélectionner toutes les tranches et une ligne par tranche options et cliquez sur OK. Enregistrez ensuite les données d’arrière-plan dans un fichier csv distinct. Ici, un cardiomyocyte unique dérivé de cellules IPS représentatif est représenté avec les lignes pointillées blanches marquant les régions d’intérêt, dessinées pendant l’analyse d’imagerie dans les canaux de DP et de GFP est montrée. Le signal du canal DP démontre une augmentation périodique de l’intensité fluorescente au cours de chaque potentiel d’action en raison d’un transfert d’énergie forcé ou de résonance croissant causé par des changements dans le potentiel membranaire.
De façon concordante, le signal GFP présente une diminution périodique de l’intensité fluorescente. Le rapport DP/GFP est le signal biologique utilisé dans les analyses en aval, comme les mesures de durée potentielle d’action 50 et 90. Par exemple, en utilisant cette méthode, ventriculaire de 30 jours comme les cardiomyocytes dérivés des cellules IPS placés à 0,5 Hertz, a montré une durée potentielle moyenne d’action 50 de 439 millisecondes, et une durée potentielle moyenne d’action 90 de 520 millisecondes.
La stimulation électrique des cardiomyocytes dérivés des cellules IPS à des taux de stimulation croissants tous les cinq battements, a démontré un raccourcissement progressif des potentiels d’action pendant que le taux de battement augmentait. En outre, le traitement des cardiomyocytes spontanément battus de cellules IPS avec l’isoproternol, un agoniste nonselectif de récepteur bêta-adreno, a mené à une augmentation prompte du taux de battement, qui pourrait être encore augmenté avec des doses croissantes de l’agoniste. Bien que cette méthode offre un débit supérieur par rapport aux mesures électrophysiologiques classiques, il faut être conscient de ses limites, y compris une résolution temporelle limitée par les propriétés cinétiques intrinsèques du capteur de tension fluorescente.
