Ce protocole peut être utilisé pour répondre à la question de savoir si et comment la fracturation hydraulique affecte les bactéries dans les cours d’eau voisins et, par extension, les cours d’eau eux-mêmes. Le principal avantage de cette technique est sa nature holistique, car elle emmène le chercheur de la collecte d’échantillons jusqu’à l’analyse des données. Jeremy Chansee, bioinformaticien dans mon laboratoire, Sydney Regal, étudiant de premier cycle au Juniata College, et Gillian Leister, ma directrice de laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Pour prélever des échantillons de sédiments pour l’extraction des acides nucléiques, utilisez des gants pour immerger un tube conique stérile de 50 millilitres dans l’eau du ruisseau à partir du rivage. Pendant que le tube est immergé, retirez le bouchon et utilisez-le pour ramasser environ trois millilitres de sédiments d’une profondeur d’un à trois centimètres dans le tube. Après avoir prélevé l’échantillon, déversez la totalité sauf un millilitre d’eau du tube et utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour ajouter trois millilitres d’AGENT DE CONSERVATION DE L’ADN ET DE L’ARN à l’échantillon.
Faire tourbillonner le tube conique bouché pendant cinq secondes pour bien mélanger l’agent de conservation et l’échantillon et stocker l’échantillon sur de la glace. À votre retour au laboratoire, conservez l’échantillon à moins 20 degrés Celsius pour l’analyse de l’ADN 16S ou à moins 70 degrés Celsius pour l’analyse de l’ARN métatranscriptomique. Pour la collecte du filtre, remplissez et videz complètement une bouteille stérile d’un litre entière avec de l’eau de flux trois fois pour conditionner la bouteille avant de la remplir une dernière fois.
Sur une surface stable, aspirez un volume complet d’eau dans une seringue stérile à verrou luer et connectez la seringue à un filtre en polyéthersulfone stérile et sans ADN / ARN de 1,7 centimètre de diamètre avec une taille de pore de 0,22 micron. Rincez tout le volume d’eau du ruisseau à travers le filtre. Lorsque tout le volume de l’échantillon a été filtré de la même manière, aspirez environ 20 millilitres d’air dans la seringue et poussez l’air à travers le filtre pour éliminer tout excès d’eau du filtre.
Ensuite, utilisez une micropipette P1000 pour ajouter deux millilitres de conservateur d’ADN / ARN à la plus grande ouverture du filtre tout en maintenant le filtre horizontalement avec l’extrémité de la pipette dans le barillet du filtre pour vous assurer que le conservateur pénètre dans le filtre. Ensuite, scellez le filtre avec des carrés de film de paraffine bien enroulés autour de chaque ouverture et placez le filtre dans un sac d’échantillon stérile sur de la glace. Au retour de l’échantillonnage, stockez les filtres pour 16S ou pour l’analyse métatranscriptomique comme démontré.
Avant de commencer un transfert d’échantillon, nettoyez la zone de travail avec 10% d’eau de Javel et 70% d’éthanol. Pour l’extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de sédiments, utilisez un outil métallique stérilisé à la flamme et à l’éthanol pour transférer environ 250 milligrammes d’échantillon dans un tube de microcentrifugation. Pour l’extraction d’acide nucléique à partir d’un échantillon de filtre, utilisez une poignée d’étau stérilisée à 70 % d’éthanol et de flamme pour ouvrir le boîtier du filtre sur la surface stérile et retirer le noyau du boîtier.
Utilisez un scalpel stérile pour trancher en haut, en bas et le long de la couture du noyau et utilisez une pince à épilester stérile pour plier le papier filtre avant de le couper en petits morceaux avec le scalpel. Ensuite, placez soigneusement les pièces filtrantes dans un tube de microcentrifugation sans entrer en contact avec des surfaces non stérilisées. Pour la lyse des cellules dans l’un ou l’autre type d’échantillon, soumettez le tube à un perturbateur cellulaire à grande vitesse.
Après au moins cinq minutes, centrifuger les échantillons et transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation stérile. Ajouter un tampon de lyse au surnageant à un rapport de un pour un et transférer la solution dans le filtre fourni. Placez le filtre dans un nouveau tube de microcentrifugation et ajoutez 400 microlitres de tampon de préparation au tube.
Après centrifugation, ajoutez 700 microlitres de tampon de lavage au tube et centrifugez à nouveau le filtre. Après avoir éliminé le débit, ajoutez 400 microlitres de tampon de lavage au tube pour une centrifugation supplémentaire et transférez le filtre dans un nouveau tube de microcentrifugation stérile. Pour éluer l’ADN, traiter le filtre avec 50 microlitres d’eau sans DNase/RNase pendant cinq minutes à température ambiante.
En attendant, placez un filtre à trois HRC dans un tube de collecte et ajoutez 600 microlitres de solution de préparation HRC. Après centrifugation, transférer le filtre dans un nouveau tube de microcentrifugation stérile et transférer l’ADN élué au filtre pour la centrifugation. Le flux contient l’ADN extrait.
Pour créer une bibliothèque d’ARN ADN 16S, utilisez d’abord le produit ADN fraîchement extrait pour l’amplification de l’ARN ribosomique 16S avec un protocole PCR standard. Mélanger sept microlitres du produit PCR résultant et 13 microlitres d’eau sans DNase et charger la solution PCR sur un gel d’agarose à 2%. Ensuite, faites fonctionner le gel à 90 volts pendant 60 à 90 minutes pour vérifier la taille d’une bande de 386 paires de bases comme preuve d’une amplification réussie.
Pour purifier la bibliothèque d’ARN ribosomique DE l’ADN 16S, remettez en commun 10 microlitres des produits de PCR qui ont produit des bandes brillantes et 13 microlitres des échantillons qui ont donné des bandes faibles dans un tube de microcentrifugation stérile et chargez environ 150 à 200 nanogrammes de chaque échantillon regroupé dans des puits individuels d’un nouveau gel de 2%. Après avoir exécuté le gel comme démontré, éliminez les 386 bandes de paires de bases du gel et utilisez un kit commercial pour purifier l’ADN. Ensuite, éluez l’ADN purifié avec 30 microlitres de chlorhydrate de Tris de 10 millimolaires et emballez les bibliothèques purifiées dans de la glace carbonique avant de les expédier pour le séquençage de nouvelle génération.
Dans cette analyse représentative, toutes les extractions, à l’exception d’une seule, seraient qualifiées de réussies. Les bandes lumineuses observées après l’amplification par PCR indiquent le succès du protocole 16S. Les échantillons 16S doivent avoir un minimum de 1 000 séquences avec au moins 5 000 étant idéales, tandis que les échantillons métatranscriptsomiques doivent avoir un minimum de 500 000 séquences avec au moins 2 millions étant idéales.
Des échantillons de sédiments provenant de 21 sites différents dans 13 cours d’eau différents pour l’analyse 16S et métatranscriptomique sont montrés. Sur ces 21 sites, 12 étaient en aval de l’activité de fracturation et classés comme fracturation hydraulique positive, et neuf étaient soit en amont de l’activité de fracturation, soit dans un bassin versant dans lequel la fracturation hydraulique était absente et classés comme fracturation hydraulique négative. Tel qu’évalué par l’analyse PERMANOVA, la séparation observée entre les données positives et négatives de fracturation hydraulique suggère que les échantillons positifs de fracturation hydraulique ont été affectés par la fracturation hydraulique.
Les prédicteurs de forêt aléatoires les plus importants révéleraient quelles caractéristiques étaient les plus essentielles pour différencier correctement les échantillons. Si un taxon est identifié comme important par le modèle forestier aléatoire, son profil de résistance aux antimicrobiens dans les échantillons positifs de fracturation hydraulique pourrait être comparé à son profil dans les échantillons négatifs de fracturation hydraulique. S’ils diffèrent considérablement, cela pourrait suggérer que le liquide de fracturation contenant des biocides est entré dans le flux.
Les microbes sont partout, de sorte que la contamination est un problème potentiel important avec ce type de travail. Les étapes initiales de transfert d’échantillon sont particulièrement sujettes à cela. Si l’on s’intéresse à la biodégradation microbienne ou à d’autres métabolismes, le séquençage de l’ARN peut être utilisé pour étudier l’expression génique microbienne active.
Cette technique permet la standardisation des techniques moléculaires pour l’étude des communautés bactériennes in situ, ainsi que des analyses bioinformatiques des données de séquences bactériennes.
