We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.

The authors have nothing to disclose.

Les méthodes présentées ici fournissent un outil pour générer une évaluation complète de la dynamique virales et microbiennes dans les écosystèmes aquatiques. Ils visent à quantifier le stock permanent de ressources organiques et inorganiques disponibles pour les communautés microbiennes et de caractériser la composition de la communauté virale et microbienne présente. En plus de la quantification de l&#39;abondance virale et de l&#39;abondance et de la biomasse microbienne, des informations de séquence génomique révèle leur structure et leur fonction communauté. Toutes les méthodes ont été développés ou modifiés pour permettre l&#39;application dans des endroits éloignés de terrain. Cependant, l&#39;absence de paramètres de laboratoire contrôlées crée par nature un certain risque d&#39;erreurs. Ici, nous discutons quelques mises en garde associées à chacun des paramètres évalués. Suivant à risque de contamination lors de la manipulation des échantillons de certains paramètres céder aussi risque d&#39;erreur dans le processus analytique. Le carbone organique dissous contamination de carbone peut se produire pendant les procédures d&#39;échantillonnage (échantillonnage en aval, ou dans le voisinage d&#39;un bateau ou plongeur), au cours de la préparation de l&#39;échantillon (contamination de l&#39;équipement ou de la manipulation par inadvertance), et même au cours du stockage de l&#39;échantillon (d&#39;autres échantillons dans le congélateur contenant organique solvants volatils /). Pour éviter les différentes sources de contamination de conduite que quelques étapes de manipulation possible, que chaque échantillon délocalisation pose une source supplémentaire de contamination. L&#39;échantillon ne doit pas entrer en contact avec un objet non lavé à l&#39;acide ou brûlés. Enfin, la désignation d&#39;un congélateur de stockage exclusivement pour les échantillons ne contenant pas de substances organiques volatiles sera d&#39;assurer l&#39;intégrité des échantillons pendant les périodes de stockage plus longues. Si les échantillons ne peuvent être congelés pendant une longue période de Voyage acidification des échantillons de DOC avec HCl concentré (comme décrit 38-41) peut être une alternative applicable. Pour vérifier les documents de référence DOC de consensus de précision de mesure doivent être utilisés regrement au cours de la mesure de la DOC fonctionne. En particulier l&#39;eau de mer profonde (&gt; 2000 m) références sont précieuses pour évaluer la performance de la machine analytique car il est très stable dans son contenu DOC 42. Matière organique particulaire En plus d&#39;éviter la contamination de carbone organique, POM échantillonnage nécessite une attention particulière pour assurer l&#39;exactitude du volume filtré. Si le volume prévu de 500 ml doit écarter pour quelque raison que ce potentiel doit être noté à rapporter la quantité de POM capturées sur le filtre pour le filtrat, dont il a été dérivé. Nutriments inorganiques Comme pour l&#39;échantillonnage de carbone organique, il faut faire attention à une éventuelle contamination de l&#39;échantillon en éléments nutritifs générés par diverses sources comme des bateaux ou des rejets d&#39;eaux usées 12. Les filtres utilisés pour l&#39;échantillonnage du carbone organique avec une tension nominale de tailles de pores de 0,8 um, peuvent ne pas exclure toute la biomasse microbienne et should donc être modifié de 0,2 pm pour les filtres de cette étape de filtration. En outre, les limites de détection posent un problème avec les échantillons des éléments nutritifs; en particulier dans l&#39;eau de surface oligotrophe autour de nombreux endroits de récifs coralliens (par exemple, Cotner et al., 43). Les limites de détection sont à peu près autour de 0,1, 0,2, et 0,1 pmol / L pour l&#39;ammonium, nitrate et nitrite, et ortho-phosphate respectivement (voir 36,12,37) Microscopie En plus des variations dans la concentration de l&#39;analyse d&#39;image des échantillons de lames de microscopie donne en outre risques d&#39;erreurs. Par exemple, les images peuvent être de mise au point dans certaines régions du champ de vision, et la mise au point dans d&#39;autres. Comme un filtre de matrice d&#39;alumine de grande pureté est un type de filtre très rigide, tous les débris sous le filtre peut entraîner l&#39;ensemble de filtre à reposer sur un angle par rapport à la glissière. En conséquence, les images peuvent être systématiquement hors foyer dans différentes parties du champ de vision pour un filtre donné, regardless de l&#39;alignement du microscope. Remontage des filtres, assurant la face inférieure du filtre est propre, peut améliorer cette si elle est observée. En outre, dans certains cas, il peut y avoir deux plans focaux dans lequel les virus et les microbes peuvent être trouvés. Ceci est le résultat d&#39;objets colorés se détacher du filtre lors du montage, et flottant à la face inférieure de la lamelle qui peut rendre compte peu fiables. Par conséquent, il est toujours recommandé de vérifier la qualité des échantillons au cours du processus. Cytométrie en flux Comme pour les échantillons de microscopie, il peut y avoir des différences entre la cytométrie de flux des échantillons qui nécessitent des ajustements du processus d&#39;analyse d&#39;origine naturelle. Par exemple, en fonction de la sensibilité de l&#39;instrument, les cellules fluorescentes Prochlorococcus faiblement peuvent être en dessous du niveau de bruit et ne seront pas quantifiés. Perles de faire un contrôle de l&#39;échantillon interne (par exemple, pour confirmer que le REEE de l&#39;instrumentonse aux signaux fluorescents est conforme au jour le jour (et reste stable pendant la course elle-même). Si elles sont ajoutées à l&#39;échantillon à des concentrations connues, ils peuvent également servir en tant que contrôle interne afin de vérifier l&#39;exécution de volume de l&#39;échantillon. Cependant, il est recommandé de toujours lancer une aliquote d&#39;un échantillon préalablement congelés &quot;standard&quot; de l&#39;eau de mer qui est décongelé et coloré avec les échantillons d&#39;intérêt à fournir un contrôle biologique supplémentaire pour la manipulation entre plaque de 96 puits pistes échantillon. En fonction de l&#39;emplacement, des échantillons d&#39;eau de mer peuvent être très différents les uns des autres. Tri populations «représentatives» et puis regarder sous un microscope à épifluorescence (EM) peut être un bon moyen de vérifier rapidement les populations de phytoplancton que soit Synechococcus sp. Ou eucaryotes photosynthétiques. Prochlorococcus cellules ne sont généralement pas visibles sous EM car elles se fanent trop vite. En plus de la chlorophylle a, Synechococcus sp. Contenir aussi le phphycoeurythrin otopigment (PE), qui émet de la lumière à des longueurs d&#39;onde plus courtes (540 à 630 nm) que la chlorophylle A (660-700 nm). Lorsque les cellules Synechococcus sont excités avec lumière bleue / verte (470-490 nm), ils apparaissent d&#39;or si on la regarde sous un filtre d&#39;émission qui supprime toutes les longueurs d&#39;onde de lumière en dessous de 510 nm. Par comparaison, la fraction eucaryote cherchera rouge, lorsqu&#39;il est excité avec la même longueur d&#39;onde de la lumière. La métagénomique des virus Il est important de noter que le processus de concentration et de stockage VLP influence de la communauté récupéré. Perte de particule virale peut survenir à chaque étape du processus, et donc, le choix des protocoles de purification et d&#39;enrichissement virales peut finalement affecter la composition taxonomique observée et la diversité des métagénomes virales résultant 44,45,18. Concentration des échantillons peut être fait en utilisant la FFT 19 ou 20 floculation à base chimique. Dans la base chimique approche, postulertivement chargée d&#39;ions de fer se lient les particules virales naturellement chargées négativement formant grandes (&gt; 8 um) des complexes de fer-virale qui floculent dans la solution et peuvent être récupérés en utilisant des filtres de 8 um. Par la suite le fer est chélaté les particules virales et re-dissous en utilisant du magnésium, de l&#39;acide ascorbique, et de l&#39;EDTA, en laissant les particules virales concentrées pour l&#39;extraction d&#39;acide nucléique 20. Après avoir comparé ces deux méthodes actuelles, nous avons conclu que la méthode de chlorure de fer est moins de temps que la FFT concentration virale, mais peut donner quelques mises en garde. Nous avons trouvé que la dissociation et la dissolution du fer-viral nécessite une deux fois la solution plus concentrée de magnésium de l&#39;acide ascorbique, de l&#39;EDTA à 20 rapporté dans le but de procéder à la dissolution avant se dégrade de l&#39;acide ascorbique. Mis à part ce problème, le protocole purifie particules virales par taille fractionnement seule, éliminer les contaminants microbiens en utilisant 0,2 um filtration. Les grands virus ne passent pas par la FILTer (par exemple, Yang et al. 46) et ne sera donc pas détecté dans le métagénome, tandis que certaines bactéries ne (McDole, données non publiées). Il en résulte une contamination bactérienne tout en discriminant contre les grands virus. Cette question spécifique est toutefois également pertinente pour l&#39;élimination des microbes dans le cadre de la concentration de la FFT. Comme a été démontré que le traitement par le chloroforme pour éliminer les virus sensibles au chloroforme des membranes lipidiques externes 47 certaines études suggèrent que 0,22 pm filtration peut être utilisé pour éliminer la majorité des bactéries. Il convient également de noter que la méthode présentée vise principalement bactériophage, le support le plus abondant de matériel génétique dans des environnements marins. Parce phages sont pas habituellement considérée contenir communément lipides 48 ils sont plus résistants au traitement de chloroforme. À notre connaissance, une méthode «fourre-tout» ne existe pas à ce jour. La méthode présentée ici est adaptée de l&#39;OUl&#39;expérience de terrain de r au cours des 10 dernières années dans divers environnements marins couvrant tropical aux systèmes arctiques. Microbienne métagénomique La construction de banques metagénomiques de microbes (par exemple, les bactéries et les archées) est plus simple que métagénomes viraux comme il est plus facile de produire des concentrations d&#39;ADN minimales requises pour la préparation de bibliothèque. Amplification fusil de chasse bibliothèques Linker (de) LASLs 17,49,50 et tout le génome amplification basée sur l&#39;amplification par déplacement multiple (MDA) sont les deux méthodes les plus couramment utilisées pour générer suffisamment d&#39;ADN pour le séquençage. L&#39;utilisation de MDA pour obtenir des concentrations d&#39;ADN plus élevées dans métagénomes microbiennes est parfois nécessaire. Il peut cependant provoquer des artefacts dans les données de séquence, telles que la suramplification de minicercles de dinoflagellés. MDA méthodes sont connues pour amplifier préférentiellement l&#39;ADN simple brin et circulaire, résultant en résultats non-quantitatives 51,52. Les LASLs optimisés approchent 50 peut donc sert comme une meilleure alternative à amplifier la fois microbienne et de l&#39;ADN métagénomique viral pour le séquençage. Il est important de noter que l&#39;approche de LASLs a plusieurs étapes, nécessite un équipement sophistiqué, et se limite à des modèles ADN double brin. En outre, le kit d&#39;extraction d&#39;ADN de tissu a été montré pour extraire l&#39;ADN des deux embranchements à Gram négatif positif et Gram, mais il n&#39;a pas été vérifiée de taxons microbienne efficace lyse récalcitrant ou leurs structures associées (par exemple, certaines archées, endospores ou des spores de champignons) . Par conséquent, une étape de battage de talon peut être nécessaire pour obtenir de l&#39;ADN à partir de certains microbes. Ces évaluations globales se traduira par une meilleure compréhension du fonctionnement virale et microbienne des écosystèmes. Bien que peu d&#39;études ont entrepris l&#39;effort d&#39;évaluer tous les paramètres proposés, beaucoup ont étudié sélectionnés. Nelson et al. 53 suggère une connexion entreen habitats récifaux spécifique, et un appauvrissement dans les deux concentrations de COD et bactérioplancton relatifs aux eaux extracôtières. Ces changements de concentration ont été accompagnés par des différenciations distinctes des communautés bactérioplancton. Dinsdale et al. 5 a montré que l&#39;augmentation de l&#39;impact anthropique a été accompagnée par une plus grande abondance de 10x cellules microbiennes et de particules pseudo-virales. Les communautés microbiennes dans les eaux marines entourant les îles habitées ont également de plus grandes fractions de bactéries hétérotrophes et des agents pathogènes potentiels 5. Enfin McDole et al. 4 a montré, en introduisant le score de microbialization, que les activités humaines se déplacent d&#39;énergie pour les microbes, au détriment des macrobes. Ces études, centrées sur les paramètres microbiens et chimiques de l&#39;eau spécifiques, fournissent de nouveaux aperçus sur la structure biochimique des écosystèmes marins. En combinant les données traditionnelles des efforts de surveillance des écosystèmes - comme température et de pH valeurs, la biomasse des poissons et diversiTy, couverture benthique, ou l&#39;exposition à l&#39;impact humain - avec la chimie de l&#39;eau et des évaluations microbiens, se traduira probablement par les efforts de surveillance de l&#39;environnement les plus sensibles, ce qui peut conduire à des efforts de conservation plus ciblés.

Les écosystèmes marins sont soumis à une large gamme de perturbations qui entraînent des changements de la disponibilité des nutriments à la biomasse des grands prédateurs. Au cours de la dernière décennie, plusieurs études ont démontré l&#39;importance des communautés microbiennes dans les écosystèmes marins 1-4. Il est évident que les changements dans la communauté bactérienne et virale sont étroitement associés à la dégradation globale de l&#39;environnement marin 5. Ces changements peuvent être facilitées par la géochimie altérée dans la colonne d&#39;eau tels que la disponibilité de l&#39;oxygène ou la reminéralisation du carbone 6,7. En raison de l&#39;interdépendance entre la macro-organismes, la chimie de l&#39;eau et activité microbienne des boucles de rétroaction peut accélérer la vitesse de dégradation de l&#39;écosystème 8. Dans les années 1970 et 80, plusieurs tentatives ont été faites pour démêler les cycles biogéochimiques dans les écosystèmes marins 9-11. L&#39;un des principaux défis pour ces premières études était le manquedes approches normalisées pour mesurer les paramètres biogéochimiques évalués. Bien qu&#39;il y avait des protocoles disponibles, principalement sur ​​les éléments nutritifs de l&#39;eau de mer 12,13, l&#39;évaluation de la dynamique du carbone et la structure de la communauté microbienne ont été limitées par les outils et méthodes disponibles. Avec la comparaison des méthodes JGOFS EqPac, Sharp et al. 14 a suggéré pour la première fois un protocole fiable et standardisée pour les évaluations carbone organique dissous (COD) de concentration. Au début des années 2000 les défis analytiques pour déterminer les ressources disponibles pour la communauté microbienne avait donc été en grande partie résolus et les approches pour caractériser les communautés microbiennes dans les milieux de culture contrôlées ont été mis en place (voir DeLong 15). Les méthodes de séquençage traditionnelles à cette époque largement appuyée sur les cultures clonales cultivées. Tôt le séquençage des gènes de l&#39;environnement d&#39;échantillons naturels a toutefois révélé que la majorité de la biodiversité microbienne a été manqué par Cultivméthodes basées ation-16. En 2002, Breitbart et al. 17 Séquençage du fusil de chasse pour la première fois pour décrire la communauté virale dans les échantillons d&#39;eau de mer de l&#39;environnement d&#39;établir une méthode de séquençage du génome entier des communautés virales marins incultes. Dans les évaluations actuelles de micro, les virus restent particulièrement sous-étudié, car la plupart sont difficiles à cultiver et ils manquent un marqueur universellement conservées comme la ARN ribosomique 16S (ARNr) des gènes habituellement utilisés pour évaluer la diversité et de la communauté profilage. L&#39;approche de séquençage métagénomique offre une alternative aux méthodes de culture-dépendante et gène-cible pour l&#39;analyse des communautés virales complexes. Alors que les premiers métagénomes virales générées à partir de l&#39;eau de mer ont été séquences en utilisant le séquençage Sanger 17, le développement des technologies de séquençage de prochaine génération et l&#39;amélioration des techniques de biologie moléculaire a conduit à une augmentation rapide dans les études de métagénomique 18 </sjusqu&#39;à&gt;. Le flux de travail de laboratoire en cours pour la métagénomique virales implique la séparation, l&#39;enrichissement et / ou de la concentration de particules virales, puis de l&#39;acide nucléique (ADN ou ARN) extraction, la préparation bibliothèque, et le séquençage 19-21. Pour approfondir les connaissances actuelles sur virale, microbienne et le fonctionnement biochimique dans les écosystèmes aquatiques, en comparant les ensembles de données dans différents systèmes dans le monde entier est essentiel. Cependant, les protocoles établis ont été largement développée pour les environnements proches du rivage avec des installations de laboratoire facilement accessibles. Ainsi, l&#39;absence de méthodes de terrain standardisés empêche ces comparaisons entre les écosystèmes. Ici, nous introduisons testé et adaptations de l&#39;état des protocoles de recherche d&#39;art bien standardisée pour utilisation dans des endroits éloignés de terrain. Ces méthodes ont fait leurs preuves avec succès dans plusieurs études couvrant la dernière décennie 5,22 et sont actuellement utilisées par les différents laboratoires marins ainsi que sur la NOAAÉvaluation de corail et Programme de surveillance (RAMP) dans tout l&#39;océan Pacifique 4. Les protocoles d&#39;échantillonnage comprennent des paramètres de l&#39;eau de la chimie (concentrations organiques et inorganiques carbone, la concentration en éléments nutritifs inorganiques), l&#39;abondance virale et microbienne (chiffres bactériennes directs, compte virales directs, et la cytométrie de flux pour évaluer autotroph vs ratios hétérotrophes), et la structure des communautés virales et microbiennes et potentiel métabolique par l&#39;analyse métagénomique (pour un aperçu, voir la figure 1). Les résultats obtenus à partir des méthodes décrites ici sont nécessaires afin d&#39;élucider les principaux paramètres de fond biogéochimiques nécessaires à la caractérisation complète des écosystèmes aquatiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1307">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:217px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:325px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Niskin collection and processing units (Hatay Niskins)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration setup&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 &#8211; 36 % Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A508-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">High-density polyethylene (HDPE) container</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Combustion oven (550&#176; C)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml HDPE vials&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02-896-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">25 mm GF/F filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-874-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>XX62-000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, non-powdered gloves</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">19-170-010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bilge pump&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Thirsty Mate 124PF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 l collapsible low-density polyethylene carboy&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Reliance Fold A Carrier II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>CFP-2-E-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum-cured silicon tubing for TFF</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>96440-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hose clamps</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>P-68007-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-77410-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8.0 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVHV010RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synthetic nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-125-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml plastic scintillation bottle&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>03-341-72C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clean bucket (10 - 20 L)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 % glutaraldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m&#160; high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DAPI solution 25 &#181;g ml-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular grade water</td>
			<td>sigma aldrich</td>
			<td>W-4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>BP351-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP399-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>G31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slide</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-550-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delicate task wipe&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide Station with vacuum pump</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">DNA extraction kit</td>
			<td style="width:217px;">Macherey-Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td>Nucleospin tissue kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Proteinase K (20 mg ml-1)</td>
			<td style="width:217px;">Lifetechnologies</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-proof 100% Ethanol</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45503-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cesium chloride (CsCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>bp1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m alumina matrix disposable syringe filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>O992613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Ultra-clear centrifuge tubes</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra - swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:149px;">333790</td>
			<td>SW41 Ti Rotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DNase I (100 u &#181;l-1)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycogen</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">G-1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 % Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:149px;">15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2473-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02674-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20 &#956;g ml-1 Proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">p3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">50ml Oak Ridge Tube&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">05-562-16B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology

Ici, nous introduisons une série de protocoles de recherche et soigneusement testés et normalisés conçus pour être utilisés dans des environnements marins éloignés. Les protocoles d&#39;échantillonnage comprennent l&#39;évaluation des ressources à la disposition de la communauté microbienne (carbone organique dissous, la matière organique particulaire, les nutriments inorganiques), et une description complète des communautés virales et bactériennes (via compte virales et microbiennes directs, le dénombrement des microbes autofluorescentes, et construction de métagénomes virales et microbiennes). Nous utilisons une combinaison de méthodes, qui représentent un champ dispersé des disciplines scientifiques comprenant des protocoles déjà établis et certaines des techniques les plus récentes développées. Techniques de séquençage métagénomique surtout utilisés pour la caractérisation virale et bactérienne communautaire, ont été mis en place que depuis quelques années, et sont donc encore soumis à l&#39;amélioration constante. Cela a conduit à une variété de méthodes d&#39;échantillonnage et de traitement de l&#39;échantillon CurrenTLY en utilisation. L&#39;ensemble des méthodes présentées ici fournit une mise à jour approche pour collecter et traiter les échantillons environnementaux. Les paramètres adressés à ces protocoles donnent le minimum sur les informations essentielles pour caractériser et comprendre les mécanismes sous-jacents de la dynamique des communautés virales et microbiennes. Il donne des directives faciles à suivre pour mener des enquêtes complètes et décrit les étapes critiques et les mises en garde potentiels pertinents pour chaque technique.

Microscopie échantillons de microscopie peuvent et doivent être analysés immédiatement pour assurer qu&#39;ils sont de la qualité souhaitée. Pour mesurer l&#39;abondance et la distribution de la taille de la communauté bactérienne, diapositives DAPI seront examinées par microscopie à épifluorescence (excitation / émission: 358/461 nm, voir McDole et al 2012). (Figure 6A). Les comptages cellulaires et les dimensions peuvent être recueillies à l&#39;aide de logiciels d&#39;imagerie (par exemple, ImagePro ou ImageJ). De volumes longueur et la largeur cellulaires (V) sont dérivés en faisant l&#39;hypothèse que toutes les cellules ont la forme de cylindres avec des bouchons hémisphériques en utilisant l&#39;équation suivante: V = π / 4 × w 2 (L - w / 3) où L est la longueur et w est la largeur de chaque cellule de 23,4. La biomasse microbienne peut alors être estimé en utilisant déjà établi des relations de taille dépendant FOr communautés microbiennes marines 24. Généralement vont bactéries marines en longueur de 0,1 à 4 pm, mais aller jusqu&#39;à ~ 8 pm dans certains endroits. Alors que les filtres (0,2 um) colorées au DAPI ne montre que les bactéries, les filtres utilisés pour la teinture SYBR Gold (0,02 um) contiennent des bactéries et des virus. La mesure de l&#39;abondance de virus suit le même protocole que pour les micro-organismes, mais une excitation de 325 à 375 nm est utilisé, et le maximum d&#39;émission est à 537 nm (Figure 6B). Afin de générer les données quantitatives du volume de prélèvement peut être nécessaire d&#39;ajuster en fonction de l&#39;abondance du virus dans l&#39;échantillon d&#39;origine. Le volume exact de filtre est mieux déterminée empiriquement pour une masse d&#39;eau. Des exemples de micrographies contenant des échantillons avec des concentrations variables virales sont illustrés à la Figure 7. Les résultats des études précédentes suggèrent que le virus de Microberatios (VMR) varient généralement de 1 à 50 dans les systèmes aquatiques 25-29, et entre 3 et 20, avec une moyenne d&#39;environ 6 dans les systèmes de récifs coralliens (Knowles données non publiées). Cytométrie en flux En plus des comptages directs et estimation de la taille de la communauté microbienne, les évaluations du rapport autotrophes à microbes hétérotrophes par cytométrie en flux peuvent en outre être extraits des échantillons prélevés (flux exemplaire cytométrie sortie donnée dans la figure 8). Pour déterminer le nombre total de cellules de bactéries, les échantillons sont colorés avec du SYBR Green I et un tube photomultiplicateur d&#39;un filtre passe-bande 530/30 est utilisé pour la détection. Un canal pour la chlorophylle (retour à miroirs de LP dos résultant dans une gamme de 675 à 735 nm) et (filtre passe-bande 585/42) phycoérythrine est utilisée pour compter l&#39;abondance des autotrophes dans des échantillons non colorés. Pour déterminer l&#39;abondance de microbes hétérotrophes, les comtes autotrophes de la nonpartie tachée sont ensuite soustrait du nombre de SYBR teinté totale (McDole et al. soumis). La métagénomique des virus Métagénomique viral utilise une approche moléculaire indépendante de la culture de l&#39;écologie virale en utilisant l&#39;information totale de la séquence génomique de déterminer la structure et la fonction communauté. La métagénomique a été faire progresser notre compréhension de la complexité et de la diversité des communautés virales au niveau local 17 à l&#39;échelle mondiale 30. Le développement récent d&#39;un large éventail d&#39;outils bioinformatiques pour l&#39;analyse de données de métagénomique virale a diminué les goulets d&#39;étranglement de calcul, permettant une vision plus globale de la de la virosphere à travers le prisme de la métagénomique. Les méthodes présentées ici mettent en évidence l&#39;isolement et l&#39;enrichissement des particules virales à partir de l&#39;eau de mer en utilisant une combinaison de pré-filtration de nylon large de la taille des pores de maille pour enlever les débris et la matière cellulaire, de la concentration deles échantillons avec de la FFT (figure 3) et une filtration subséquente de 0,45 um pour éliminer les cellules plus grandes. Cette méthode produit environ un 100x échantillon concentré (figures 5B-5E) qui nous permet d&#39;effectuer des procédés en aval dans les petits volumes. Afin d&#39;empêcher la croissance de toutes les cellules microbiennes qui restent dans le lysat viral et par conséquent des changements dans l&#39;abondance viral de l&#39;échantillon au cours du temps de transit de temps entre la station de terrain et en laboratoire, le chloroforme est souvent ajouté à une concentration finale de 2% pour le stockage. Suite à l&#39;isolation et la purification des VLP, la microscopie à épifluorescence avec des colorants d&#39;acides nucléiques tels que l&#39;or SYBR sont utilisés pour vérifier la présence et la pureté des particules virales (figures 5B-5E). Ici, nous présentons deux métagénomes virales de la barrière de corail sud de l&#39;île de ligne, en particulier, le Starbuck (STAR7) et du Millénaire (CAR9; précédemment connu sous le nom Caroline) îles. Un volume total de 120 L sample eau ont été recueillies à partir de chaque site à une profondeur de 10 mètres et traité comme décrit dans la section 3.7 et 5.2. Les VLP purifiées à partir de la centrifugation sur gradient de chlorure de césium était 3,3 x 10 8 particules / ml pour CAR9 (Figure 5D) et 2,9 x 10 9 particules par ml pour STAR7 vérifiée selon la méthode décrite au paragraphe 4 (figure 5B). La quantité totale d&#39;ADN isolé à partir de ces échantillons étaient d&#39;environ 400 ng basée sur la mesure de Nanodrop. L&#39;ADN a été amplifié à l&#39;aide Phi29 polymérase et séquencé par le Fonds pour l&#39;environnement génomique de base en 2011. Les caractéristiques des données de séquence est présentée dans le tableau 1. Sur la base de recherches de similarité en utilisant les bases de données existantes, la majorité (&gt; 70%) des séquences souvent fini , à savoir les origines et les fonctions inconnues non caractérisés. De même, les deux viromes présentées ici ont présenté plus de 97% de séquences inconnues. En conséquence, non-base de donnéesanalyse dépendante a été utilisé pour l&#39;analyse et a ouvert un nouveau bras de possibilité de recherche sur la «matière noire» dans la métagénomique virales (Seguritan et al. sous presse). Microbienne métagénomique L&#39;analyse de métagénomes microbiennes permet de caractériser de la communauté microbienne présente et la description fonctionnelle de ces communautés. Les exemples incluent des estimations de la présence d&#39;agents pathogènes et la virulence 5,22 ou des comparaisons entre les changements dans la structure des communautés macrobial ou de nutriments disponibles et l&#39;abondance des espèces et de leurs voies métaboliques prédominent (figure 9; Kelly et al 2014).. chimie de l&#39;eau paramètres chimiques de l&#39;eau ont généralement un traitement complet d&#39;analyse pour générer les données souhaitées; échantillons pour l&#39;analyse du COD seront mesurés par oxydation à haute température catalytique 31,32, la matière organique particulaire (POM) par rapport isotopique par spectrométrie de masse couplée à un analyseur élémentaire 33-35, et les nutriments inorganiques par Flow Injection Analysis 36,12,37. Après une réussite de toutes les analyses, informations comme indiqué dans le tableau 1 sera disponible pour compléter la caractérisation du microbienne et des communautés virales. Cette information peut être complétée par des ratios d&#39;isotopes stables d&#39;échantillons de carbone et d&#39;azote organique (Voir Haas et al. 35) et les rapports entre autotrophes et hétérotrophes (McDole et al. Soumis). <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" width="600" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble des méthodes décrites dans la section de protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figu</a>re. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" /> Figure 2. Exemple de configuration traitement de forage. L&#39;installation de filtration introduit ici (schéma à gauche, image réelle panneau de droite) ne doit pas nécessairement pour générer des échantillons mais permettra d&#39;accélérer le processus de manière significative. L&#39;installation se compose d&#39;une plaque, sur laquelle les unités Hatay Niskin (1) sont montés. A la sortie vers le bas, les unités Hatay Niskin sont connectés avec un tube de silicone pour les porteurs (2) filtre en ligne. Ces laissez-passer l&#39;eau échantillonnée à travers le filtre respectif dans les flacons PEHD d&#39;échantillonnage (3) monté juste en dessous. Le procédé de filtration est accéléré à travers l&#39;air sous pression (4), qui et réglé par une jauge de pression (5). Un bassin de débordement empêche renverser de l&#39;eau au cours de l&#39;évolution des flacons en PEHD ou filtration de POM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît</a>cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig3highres.jpg" /> L&#39;eau de l&#39;échantillon 3. La figure tangentielle gamme de filtration d&#39;écoulement (modifié à partir de Thurber et al. 19). Maille de nylon filtrée est pompée à partir du réservoir (1) par l&#39;intermédiaire d&#39;une pompe péristaltique (2) à un filtre à flux tangentiel (3). L&#39;échantillon d&#39;eau revient au réservoir (1) le long de la ligne de retour (4) en l&#39;absence de contre-pression. Lorsque la contre-pression est appliquée au moyen d&#39;un collier de serrage (5) sur la ligne de retour, l&#39;eau passe à travers le filtre et est délivrée au rebut ou vers le réservoir de filtrat (6). l&#39;eau de l&#39;échantillon est remplacé comme il est concentré sur la ligne filtrat jusqu&#39;à ce que toute l&#39;eau de l&#39;échantillon est concentré dans les tubulures. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" /> Figure 4. Microscope installation de filtration de diapositive.Pour répartir uniformément DAPI et SYBR or échantillons colorés sur le filtre de matrice d&#39;alumine (1) respective, les filtres doivent être placés entre la tour de filtre (2) et de la tige du collecteur de filtration et fixé avec une pince (4). Un vide réglementé de pression (5) permettra d&#39;accélérer le processus de filtration (en haut de schéma, réelle panneau inférieur de l&#39;image). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" /> Figure 5. La purification et la concentration de particules de phage. Un total de 1 ml de chaque gradient de densité de chlorure de césium sont posés l&#39;un sur l&#39;autre avant de diriger l&#39;échantillon pré-traité (A). Chaque couche doit être marquée à l&#39;extérieur du tube pour faciliter l&#39;extraction après ultracentrifugation. Les flèches rouges où le tube sera percé à l&#39;extracter la fraction de VLP. (BE) micrographies des concentrés viraux: micrographies épifluorescence de 0,45 um filtrées concentrés viraux représentatifs de STAR7 (B) et CAR9 (D). Les grosses particules, y compris les cellules bactériennes ont été visibles à partir de 0,45 um les filtrats des deux-STAR7 (B) et (D) CAR9 échantillons, tandis que des VLP (flèches blanches) restent après gradient de chlorure de césium ultracentrifugation; 7 étoiles (C) et CAR9 (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" /> Figure 6. Exemple de DAPI et or SYBR analyse micrographique. D&#39;écran à partir de l&#39;analyse de (A) et DAPI (B) or SYBR teinté exemple de glissière. (A) La longueur et la largeur (um) de toutes les particules mises en évidence(= Microbes) peuvent être évalués à l&#39;aide d&#39;un programme d&#39;imagerie. Noter l&#39;agrégation dans le centre de l&#39;image. Ces groupes doivent être exclus de l&#39;analyse ultérieure. (B) Au cours de l&#39;analyse des virus et des bactéries ont besoin d&#39;être mis en cellule par des seuils de taille et de VLP dans des gammes de taille cellulaire (VLP rouge, vert cellulaire). Notez qu&#39;il existe généralement des VLP faibles Non classé par le programme d&#39;imagerie respectif. Ces VLP apparaissant points blancs faibles doivent être comptabilisés et ajoutés aux comptes virales automatisés manuellement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" /> Figure 7. Les concentrations de SYBR or teinté échantillons. Micrographies d&#39;un filtre 0,02 matrice alumine contenant différents nombres de SYBR teinté échantillons de virus. Le panneau A montre afilter contenant une quantité appropriée d&#39;eau de mer filtrée, alors que les concentrations sur le filtre de la B sont trop élevés et en C trop faible pour compte fiables. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" width="600" /> Figure 8. Résultats de cytométrie en flux de sortie de l&#39;analyse d&#39;un échantillon récif-eau. Panneau (A) montre l&#39;eau moléculaire de qualité uniquement avec des microsphères fluorescentes jaune-vert (0,75 um), utilisés pour vérifier fond minimale avec les réglages de l&#39;appareil. Groupe (B) représente la sortie de l&#39;échantillon d&#39;eau de récif terme avec des réglages identiques et la mise en page que dans A. Notez que les perles peuvent encore être vus dans le même endroit, ainsi que plusieurs populations de autotrophes. (C) </strong&gt; Le même échantillon que dans (B), utilisé pour sauvegarder porte le cytomètre en flux, en ciblant les événements positifs de SYBR (autotrophes + comptage hétérotrophe) et en minimisant fond. (D) L&#39;échantillon récif-eau représentant colorées avec SYBR Green I. Utilisation le déclenchement établi à (C), le nombre total de microbes ont été générés, et les microbes hétérotrophes et autotrophes cloisonnés par la chlorophylle autofluorescence (voir McDole et al. 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" width="600" /> Figure 9. Exemple de données sur le métagénome microbien. Patterns entre les données de séquence de métagénomique microbienne et variables dépendantes du site. Ici, l&#39;abondance relative de Synechococcus </em&gt; spp. est positivement corrélé avec le couvercle de pour cent de corail, tandis que Pelagibacter spp. n&#39;a pas été (panneaux de gauche). La voie métabolique pour le transfert de conjugaison a été positivement corrélé avec les concentrations de nitrates, tandis que la voie métabolique de réparation de l&#39;ADN était cohérente entre tous les métagénomes (panneaux de droite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 7 étoiles </td><td> CAR9 </td></tr><tr><td> Nombre total de Lit </td><td> 939311 </td><td> 591600 </td></tr><tr><td> Nombre de Prétraitment Lit </td><td> 579664 </td><td> 360246 </td></tr><tr><td> Séquence longueur moyenne (pb) </td><td> 395 ± 131 </td><td> 451 ± 159 </td></tr><tr><td> Séquences annotées (en%) </td><td> 42 218 (7,3%) </td&gt; <td> 9117 (2,5%) </td></tr><tr><td> Inconnu (%) </td><td> 537 446 (92,7%) </td><td> 351 129 (97,5%) </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Caractéristiques techniques de deux viromes générés par les îles de la Ligne du Sud, Starbuck et du Millénaire. Le degré d&#39;annotation est basé sur BLAT utilisant le serveur MG-RAST. <img alt="Tableau 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" width="700" /> Tableau 2. Les résultats représentatifs indiquent les données de différents sites au cours d&#39;une expédition. Les paramètres évalués ici de mesures de la chimie de l&#39;eau jumelé avec microbienne et abondances virales. Le tableau contient en outre des noms de fichier se référant à des données de métagénomique respectifs pour chaque emplacement d&#39;échantillonnage. concentrations de carbone et des nutriments inorganiques sont donnés en pmol / L. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" target="_blank">Se il vous plaît</a>cliquez ici pour voir une version plus grande de cette table.

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Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Démêler les joueurs invisibles dans l&#39;océan - un guide de terrain à la chimie de l&#39;eau et de microbiologie marine

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

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Research

JoVE Journal

Environment

25.2K vues.  San Diego State University. Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments. 

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A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

This bioassay employs a model predatory fish to assess the presence of feeding-deterrent metabolites from organic extracts of the tissues of marine organisms at natural concentrations using a nutritionally comparable food matrix.

Un poisson-alimentation Laboratoire d&#39;essais biologiques pour évaluer l&#39;activité antiprédatrices des métabolites secondaires dans les tissus d&#39;organismes marins

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

Recherche

Environnement

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Sélection de la taille Gel automatisé pour améliorer la qualité des bibliothèques de séquençage de prochaine génération Préparé à partir d&#39;échantillons d&#39;eau de l&#39;environnement

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

Un test PCR Duplex numérique pour simultanée Quantification de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Et le HF183 marqueur humain Fecal associé dans les eaux

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

Clean Échantillonnage et analyse de la Rivière et estuariens Waters pour Trace études métalliques

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VACUSIP, une méthode Inex améliorée pour<em&gt; In Situ</em&gt; Mesure des particules et composés dissous transformés par suspensivores actifs

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an &#187;A frame&#171; attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

The protocol below describes the methodology for: microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastic and chemical identification of particles. This protocol is in line with the recommendations for microplastics monitoring published by the MSFD Technical Subgroup on Marine Litter.

Protocole pour microplastiques échantillonnage sur la surface de la mer et analyse des échantillons

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Controlled-release of Chlorine Dioxide in a Perforated Packaging System to Extend the Storage Life and Improve the Safety of Grape Tomatoes

A controlled-release chlorine dioxide (ClO2) pouch was developed by sealing a slurry form of ClO2 into semipermeable polymer film; the release properties of the pouch were monitored in containers with or without fruit. The pouch was affixed to the inside of a perforated clamshell containing grape tomatoes, and the effect on microbial population, firmness, and weight loss was evaluated during a 14 day storage period at 20 &#176;C. Within 3 days, the ClO2 concentration in the clamshells reached 3.5 ppm and remained constant until day 10. Thereafter, it decreased to 2 ppm by day 14. The ClO2 pouch exhibited strong antimicrobial activity, reducing Escherichia coli populations by 3.08 log CFU/g and Alternaria alternata populations by 2.85 log CFU/g after 14 days of storage. The ClO2 treatment also reduced softening and weight loss and extended the overall shelf life of the tomatoes. Our results suggest that ClO2 treatment is useful for extending the shelf life and improving the microbial safety of tomatoes during storage without impairing their quality.

Here, we describe a protocol for the application of a novel, slow-release ClO2 product that reduces spoilage and extends the shelf life of fresh fruit. The slow-release ClO2 product was added to standard commercial grape tomato packaging and tested against Escherichia coli and Alternaria alternata.

À libération contrôlée de dioxyde de chlore dans un système d&#39;emballage perforé pour prolonger la vie de stockage et améliorer la sécurité des tomates raisin

A controlled-release chlorine dioxide (ClO2) pouch was developed by sealing a slurry form of ClO2 into semipermeable polymer film; the release properties ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment during manufacturing and transport. Because of their environmental persistence, they are widely distributed in the oceans and on beaches all over the world. They can act as a vector of potentially toxic organic compounds (e.g., polychlorinated biphenyls) and might consequently negatively affect marine organisms. Their possible impacts along the food chain are not yet well understood. In order to assess the hazards associated with the occurrence of plastic pellets in the marine environment, it is necessary to develop methodologies that allow for rapid determination of associated organic contaminant levels. The present protocol describes the different steps required for sampling resin pellets, analyzing adsorbed organochlorine pesticides (OCPs) and identifying the plastic type. The focus is on the extraction of OCPs from plastic pellets by means of a pressurized fluid extractor (PFE) and on the polymer chemical analysis applying Fourier Transform-InfraRed (FT-IR) spectroscopy. The developed methodology focuses on 11 OCPs and related compounds, including dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its two main metabolites, lindane and two production isomers, as well as the two biologically active isomers of technical endosulfan. This protocol constitutes a simple and rapid alternative to existing methodology for evaluating the concentration of organic contaminants adsorbed on plastic pieces.

Microplastics act as vector of potentially toxic organic contaminants with unpredictable effects. This protocol describes an alternative methodology for assessing the levels of organochlorine pesticides adsorbed on plastic pellets and identifying the polymer chemical structure. The focus is on pressurized fluid extraction and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy.

Extraction de pesticides organochlorés à partir de granulés en plastique et analyse de type plastique

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

balane Balanus improvisus comme modèle Marine - culture et l’Expression des gènes

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Construction of a Low-cost Mobile Incubator for Field and Laboratory Use

Incubators are essential for a range of culture-based microbial methods, such as membrane filtration followed by cultivation for assessing drinking water quality. However, commercially available incubators are often costly, difficult to transport, not flexible in terms of volume, and/or poorly adapted to local field conditions where access to electricity is unreliable. The purpose of this study was to develop an adaptable, low-cost and transportable incubator that can be constructed using readily available components. The electronic core of the incubator was first developed. These components were then tested under a range of ambient temperature conditions (3.5 &#176;C - 39 &#176;C) using three types of incubator shells (polystyrene foam box, hard cooler box, and cardboard box covered with a survival blanket). The electronic core showed comparable performance to a standard laboratory incubator in terms of the time required to reach the set temperature, inner temperature stability and spatial dispersion, power consumption, and microbial growth. The incubator set-ups were also effective at moderate and low ambient temperatures (between 3.5 &#176;C and 27 &#176;C), and at high temperatures (39 &#176;C) when the incubator set temperature was higher. This incubator prototype is low-cost (&lt; 300 USD) and adaptable to a variety of materials and volumes. Its demountable structure makes it easy to transport. It can be used in both established laboratories with grid power or in remote settings powered by solar energy or a car battery. It is particularly useful as an equipment option for field laboratories in areas with limited access to resources for water quality monitoring.

This paper describes a method for building an adaptable, low-cost and transportable incubator for microbial testing of drinking water. Our design is based on widely available materials and can operate under a range of field conditions, while still offering the advantages of higher-end laboratory-based models.

Construction d’un incubateur de Mobile Low-cost pour le terrain et de laboratoire

Incubators are essential for a range of culture-based microbial methods, such as membrane filtration followed by cultivation for assessing drinking water ...