Le financement des aspects de ce travail a été fourni par différentes sources, y compris le Département américain de l&#39;Agriculture de l&#39;accord de coopération spécifique 58-6408-1-595 et la National Science Foundation (prix 1049911).

Colorimétrique Analyse des extracellulaire activité enzymatique dans les sols et les sédiments Une. Préparation du substrat et solutions tampons pour les analyses colorimétriques de l&#39;activité enzymatique <ol><li> H préparer tampon acétate 50 mM (pH 5,0 à 5,5), en mélangeant 50 ml de 0,1 M d&#39;acide acétique (2,87 ml d&#39;acide acétique glacial dans 500 ml d&#39;eau), 150 ml de 0,1 M d&#39;acétate de sodium et 200 ml d&#39;eau distillée 2 O. Ajuster le pH à 5,0 à 5,5 avec 0,1 M d&#39;acide acétique, si nécessaire. </li><li> Préparer une solution de 1 M d&#39;hydroxyde de sodium (NaOH) dans l&#39;eau distillée 2 O. </li><li> Préparer des solutions de substrat de NP lié p dans 50 mM de tampon acétate. Pour doser la phosphatase préparer 5 mM p NP-phosphate dans 50 mM de tampon acétate, pour doser β-glucosidase préparer 5 mM p NP-β-glucopyranoside, pour doser NAGase préparer 2 mM pNP-β-N-acétyl-glucosaminide. Préparer toutes les solutions de substrat dans stériles 15 ml ou 50 ml tubes de centrifugation. Les solutions peuvent être stockées à 4 ° C pendant 2 à 3 semaines. </li></ol> 2. Détermination d&#39;une norme pour convertir l&#39;absorbance à p NP Concentration <ol><li> Préparer des solutions standard de p-nitrophénol dans 50 mM de tampon acétate. Les concentrations devraient varier de 0,025 à 1 mM. </li><li> Transfert trois répétitions de 100 pi de chaque concentration à une microplaque de 96 puits clair. Ajouter 10 ul de NaOH 1 M et 190 ul de H 2 O distillée à chaque puits. </li><li> absorbance record à 410 nm en utilisant un lecteur de microplaques. </li><li> Concentrations se multiplient dans la courbe standard par 0,3 pour obtenir micromoles p NP par 300 volume de réaction ul. Tracer la courbe d&#39;absorbance en fonction pmol de p NP. La pente de la courbe sert de facteur de conversion (C) qui se rapportent à l&#39;absorbance umole de p NP dans chaque réaction enzymatique. </li></ol> 3. Conduite de l&#39;Enzyme Assay <ol><li> Pour le sol, préparer une suspension de chaque échantillon à analyser dans un 15 ml tube à centrifuger stérile à une concentration d&#39;environ 1 g / ml-1 en utilisant 50 mM de tampon acétate. Pour les sédiments, ajouter un tampon d&#39;acétate assez pour faire la bouillie facilement pipettable. Le volume exact de bouillie nécessaire variera en fonction du nombre d&#39;enzymes testés, mais un minimum de 5 ml est recommandé. Vortex chaque suspension jusqu&#39;à ce que toutes les mottes de terre ou les sédiments se sont dispersés et noter le volume final. </li><li> Re-vortex chaque suspension et la pipette juste 150 pi dans chacun des six puits sur un bloc de 96 puits deepwell (Figure 1). Il est important de vortex complètement et fréquemment afin de maintenir les particules de sol en suspension. Laisser au moins deux puits par bloc vide pour servir de contrôle de substrat. Remarque: clip la fin de pointes de pipettes avec des ciseaux avant de pipetage comme les boues, ont tendance à obstruer conseils. Préparer un bloc à 96 puits pour chaque enzyme à doser. </li><li> Verser environ 5 ml de tampon acétate dans un réservoir de pipette et en utilisant une pipette à 8 canaux d&#39;ajouter 150 ul du tampon à la last deux puits de chaque échantillon (ce seront des contrôles de tampon échantillon) et les deux puits de contrôle de substrat (Figure 1) </li><li> Verser environ 10 ml de la solution de NP-substrat p appropriée dans un réservoir de pipette et en utilisant une pipette à 8 canaux d&#39;ajouter 150 ul de la solution de substrat pour les quatre premiers puits de chaque échantillon et les deux puits de contrôle de substrat (Figure 1). Noter le temps que la réaction commence dès que la solution de substrat est ajouté. </li><li> Incuber les plaques à température ambiante (22 ° C) pendant 0,5-4 h. Temps d&#39;incubation exacte varie en fonction du niveau d&#39;activité dans les échantillons et l&#39;enzyme à doser. Pour la plupart des sols et des sédiments, de la phosphatase et de β-glucosidase nécessitent des temps d&#39;incubation de 0,5 à 1,5 heures, tandis que la NAGase et d&#39;autres enzymes nécessitent des temps d&#39;incubation de&gt; 2 h. </li><li> Bien que des essais sont en période d&#39;incubation préparer clair microplaques de 96 puits à l&#39;absorbance. Préparer une microplaque pour chaque bloc deepwell (c&#39;est à dire pour chaque enzyme dosé). Introduire à la pipette 10 ul de NaOH 1 M et 190 ul d&#39;eau distillée dans chaque puits de la microplaque. Remarque: NaOH ralentit la réaction enzymatique et augmente le pH qui améliore la couleur de la NP p libéré pendant la réaction. </li><li> Après incubation, centrifuger les blocs de 96 puits à 2000-5000 x g pendant 5 min pour sédimenter les particules du sol. </li><li> Utilisez une pipette multicanaux de retirer 100 pi de chaque puits, en veillant à éviter le culot, et le transférer dans le puits correspondant à préparé microplaque de 96 puits clair. </li><li> Allumez le lecteur de microplaques et mettre en place les logiciels nécessaires. absorbance record à 410 nm. Si l&#39;absorbance d&#39;un bien donné est au-dessus de la limite de détection linéaire du lecteur de plaques, diluer ainsi que 1:01 avec de l&#39;eau et re-mesure. Si l&#39;absorbance est encore trop élevé, le test doit être répété avec un temps d&#39;incubation plus courte. </li></ol> 4. Détermination de la masse sèche des échantillons <ol><li> Introduire à la pipette 1 ml de chaque sampl<html> e bouillie dans une casserole en aluminium préalablement pesée. </li><li> Sécher dans une étuve de séchage à 75 ° C pendant 48 h et peser. Soustraire le poids de la cuve à partir de cette valeur pour obtenir la masse sèche du sol ou de sédiment dans 1 ml de la suspension. Multiplier par un facteur de 0,15 pour déterminer la masse sèche de l&#39;échantillon dans les 150 ul ajoutés à chaque puits dans le dosage d&#39;enzyme. </li></ol> 5. Calcul de l&#39;activité enzymatique par masse sèche de sol ou les sédiments <ol><li> Calculer l&#39;absorbance finale de chaque échantillon en soustrayant l&#39;absorbance de l&#39;échantillon de contrôle à partir de l&#39;absorbance de l&#39;échantillon d&#39;essai. Si les contrôles de substrat ont une forte absorption (environ&gt; 0,060) alors soustraire ceux aussi. </li><li> Calcul de l&#39;activité enzymatique en pmoles hr -1 -1 g de matière sèche à partir de l&#39;équation: </li></ol> l&#39;activité de l&#39;enzyme = absorbance finale / (C x temps d&#39;incubation x échantillon masse sèche) Analyse fluorescent de extracellulaire activité enzymatique dans les eaux naturelles TLE &quot;&gt; 1. Préparation du support, Standard et solutions tampons pour analyses fluorométriques de l&#39;activité enzymatique <ol><li> Préparer 200 uM des solutions de substrats MUB-liés (par exemple 4-MUB-β-glucopyranoside, le 4-MUB-phosphate, le 4-MUB-N-acétyl-β-D-glucosaminide) en dissolvant le substrat approprié dans stérile (autoclavée) distillée H 2 O dans 15 ml stériles ou 50 ml tubes de centrifugation. Enveloppez tubes en papier d&#39;aluminium pour exclure la lumière et stocker au réfrigérateur avant de l&#39;utiliser. Les substrats doivent être stables pendant au moins 1 semaine si elles sont stockées de cette manière. </li><li> Préparer une norme MUB en faisant une solution stock de 100 uM 4 méthylumbelliférone dans de l&#39;eau distillée stérile 2 O. Conserver au réfrigérateur dans de l&#39;ambre ou bouteille en aluminium gainé. Immédiatement avant utilisation, diluer la solution 100 uM d&#39;actions par 1/10 en H 2 O stérile pour obtenir une solution de travail de 10 uM pour les dosages enzymatiques. </li><li> Préparer une solution stock de tampon de bicarbonate 100 mM en dissolvant 8,4 g de NaHCO &lt;sub&gt; 3 en 1 LH 2 O et autoclave. Diluer cette solution mère 1/20 en H 2 O stérile si nécessaire pour obtenir une solution de travail de 5 mm pour les dosages enzymatiques. </li></ol> 2. Organiser des échantillons d&#39;eau sur un 96 puits noir microplaques <ol><li> Organiser une microplaque pour chaque enzyme suivant l&#39;exemple représenté sur la figure 2. Notez que pour permettre la réplication adéquat, des normes et des contrôles, cette procédure peut doser l&#39;activité d&#39;une enzyme unique pour un maximum de neuf échantillons d&#39;eau sur une microplaque à 96 puits noir. </li><li> Verser environ 5 ml du premier échantillon dans un réservoir de pipette et utiliser une pipette à 8 canaux à pipette200 ul dans tous les puits de la colonne 1 de la microplaque (s). Jeter les embouts de pipette neufs et répéter au besoin pour chaque échantillon d&#39;eau pour remplir les colonnes 1-9. </li></ol> 3. Mise en place d&#39;échantillon, Standard, prend goût, et des contrôles de substrat <ol><li> Mettre en place des contrôles pour tenir compte des échantillons, standardss, et le substrat de trempe sur la même microplaque noire que les échantillons (Figure 2). </li><li> Contrôles exemples contiennent de l&#39;eau de l&#39;échantillon et le tampon bicarbonate, et ne sont pas utilisées dans les calculs d&#39;activité mais démontreront lecture cohérence tout au long de l&#39;expérience. Les contrôles de trempe sont constitués d&#39;eau de l&#39;échantillon et une quantité standard de l&#39;étiquette fluorescente et sont utilisés pour mesurer la diffraction de la fluorescence dans l&#39;eau de l&#39;échantillon. Substrat et contrôles standard sont constitués de tampon de substrat soit lié ou le marqueur fluorescent standard, respectivement, et le bicarbonate. </li><li> Verser environ 5 ml de 5 mM de tampon de bicarbonate dans un réservoir de pipette propre. Pipette 50 ul de tampon dans les puits de la microplaque de 1 à 9 dans les lignes D et E pour former deux puits réplicats de commandes d&#39;échantillon par échantillon. Changer d&#39;embout de pipette puis transférer 200 pi de tampon bicarbonate de puits 10 à 12 dans les lignes A et H. </li><li> Réduisez l&#39;éclairage ambiant par gradation ou d&#39;éteindre lipo ds que la norme fluorescent est sensible à la lumière. </li><li> Verser environ 5 ml de 10 pM de 4-méthylumbelliférone dans un réservoir de pipette propre. Pipette 50 ul dans les puits de la microplaque de 1 à 12 dans la ligne H, et dans les puits 1 à 9 dans les lignes G et F pour former trois répétitions de contrôles de trempe par échantillon et l&#39;ensemble des contrôles standard. Soit placer la microplaque dans l&#39;obscurité ou couvrir avec un couvercle opaque pour réduire la dégradation de la lumière MUB. </li><li> Allumez le fluorimètre et mettre en place les logiciels nécessaires pour être prêt à lire avant d&#39;ajouter le substrat. Note: certaines ampoules fluorimètre peuvent nécessiter un temps d&#39;échauffement de 3 minutes ou plus. </li><li> Verser environ 5 ml de substrat approprié MUB-lié (par exemple 4-MUB-phosphate) dans un réservoir de pipette propre. Utilisez une pipette 12 canaux à la pipette 50 ul dans les puits de la microplaque de 1 à 12 dans la ligne A, et dans les puits 1 à 9 dans les lignes B et C pour former trois essais répétés pour chaque échantillon et trois contrôles de substrat. Immediately passez à l&#39;étape 4.1, fluorescence d&#39;enregistrement. </li></ol> 4. Fluorescence enregistrement <ol><li> Lire la fluorescence initiale immédiatement après l&#39;addition de substrat à la microplaque. Après la lecture de la fluorescence, incuber la microplaque à température ambiante (22 ° C), soit dans le noir ou recouvert d&#39;un couvercle opaque pour réduire la dégradation de la lumière MUB. </li><li> Le temps d&#39;incubation nécessaire pour mesurer l&#39;activité enzymatique maximale possible dans un échantillon d&#39;eau va dépendre de la concentration d&#39;enzyme dans l&#39;échantillon. Etant donné que ce n&#39;est pas connue avant le dosage est terminé, la microplaque devra être lu à intervalles de temps multiples. Typiquement, la lecture à des intervalles de 10-15 minutes au cours de 1 h est acceptable pour de nombreuses enzymes, bien que les échantillons avec une activité très élevée pour certaines enzymes peuvent culminer avant 10 min. </li><li> Continuer la lecture de fluorescence dans la microplaque à vos intervalles désignés pendant au moins 1 heure. Soyez sûr de garder la microplaque couvert ou dans l&#39;obscurité entre la lectures. </li></ol> 5. Calcul de l&#39;activité enzymatique par volume d&#39;eau <ol><li> Pour chaque échantillon à chaque intervalle de temps de calculer les: fluorescence moyenne de l&#39;échantillon initial (puits D et E), la fluorescence de l&#39;échantillon final moyen (puits AC), la fluorescence moyenne standard (puits H10-11), et la moyenne étancher fluorescence de contrôle (puits FG). </li><li> Pour chaque intervalle de temps, calculer l&#39;activité enzymatique en nmoles ml -1 h -1 à partir de l&#39;équation: </li></ol> l&#39;activité de l&#39;enzyme = (fluorescence moyenne de l&#39;échantillon - fluorescence moyenne de l&#39;échantillon initial) / ((fluorescence moyenne / 0,5 mole) x standards (moyenne étancher fluorescence de contrôle / moyenne de fluorescence) x standards (0,2 ml) x (temps en h)) <ol start="3"><li> Examiner les valeurs de l&#39;activité calculée pour chaque pas de temps. Déterminer l&#39;activité de potentiel final de l&#39;étape de temps avec la plus forte activité. Si les valeurs d&#39;activité continuent d&#39;augmenter alors pas de temps plus tard, peuvent être nécessaires, si les valeurs d&#39;activité tombent Throughout cours de l&#39;exécution, puis exécutez à nouveau avec plus courts intervalles de temps. Dernière activité est en nmoles de substrat consommée h -1 ml -1, mais peut être étendu à exprimer comme micromoles h -1 L -1. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Détermination de l&#39;activité d&#39;une variété d&#39;enzymes extracellulaires microbiennes dans les sols et les sédiments peut fournir des indications utiles sur les taux de minéralisation des éléments nutritifs et de matière organique traitement 17. Cependant, les sols peuvent varier dans leurs niveaux d&#39;humidité, il est donc important de normaliser l&#39;activité de sol poids sec. Cela nécessite une étape de séchage supplémentaire (typiquement de deux jours) au-delà de la simple mesur...

Les micro-organismes tels que les bactéries et les champignons d&#39;obtenir les nutriments et de carbone à partir de composés organiques complexes, grâce à la production d&#39;enzymes extracellulaires. Ces enzymes hydrolysent typiquement des polymères en sous-unités plus petites qui peuvent être prises dans la cellule. Par conséquent, au niveau écologique, ces enzymes extracellulaires microbiennes sont en grande partie responsables de la minéralisation des éléments nutritifs et de la décomposition de la matière organique qui se produit dans les milieux naturels. Des enzymes telles que la cellobiohydrolase (CBH), β-glucosidase et sont importants pour la dégradation de la cellulose et de travail à l&#39;unisson pour catalyser l&#39;hydrolyse de la cellulose en glucose 1,2, ce qui donne un substrat de carbone utilisables pour l&#39;absorption et l&#39;assimilation microbienne. La phosphatase enzyme libère solubles groupes phosphates inorganiques de organophosphates, essentiellement de minéralisation du phosphate et de la rendre disponible pour une utilisation par la plupart des organismes 3. D&#39;autres enzymes, telles que la N-acétylglucosaminidase (NAGase), sont important dans la dégradation de la chitine et peut faire à la fois du carbone et de l&#39;azote disponible pour l&#39;acquisition microbienne 4. Une des procédures pour le dosage de l&#39;activité enzymatique extracellulaire microbienne dans les milieux naturels est l&#39;utilisation d&#39;artificiel p-nitrophényl (p NP) des substrats liés, une approche qui a été initialement développé pour détecter sol activité de la phosphatase 5. Cette approche repose sur la détection d&#39;un produit final coloré, le p-nitrophénol, qui est libéré lorsque le substrat artificiel est hydrolysé par l&#39;enzyme appropriée. Le p-nitrophénol peut ensuite être quantifié par colorimétrie en mesurant son absorbance à environ 400-410 nm. Cette méthode a depuis été appliquée pour détecter d&#39;autres enzymes telles que la NAGase 6, et a été utilisé dans diverses études portant sur ​​l&#39;activité enzymatique extracellulaire microbienne dans les sols et les sédiments 9.7. Une approche alternative qui était originally développé pour évaluer l&#39;activité glucosidase extracellulaire dans les milieux aquatiques 10,11 rend l&#39;utilisation de 4-méthylumbelliférone (IUM) substrats liés. Le produit final libéré (4-méthylumbelliférone) est hautement fluorescent et peut être détectée en utilisant un fluorimètre avec un paramètre d&#39;excitation / émission d&#39;environ 360/460 nm. Une variété de substrats artificiels MUB-liés sont disponibles, permettant la mesure fluorométrique de l&#39;activité d&#39;au moins autant d&#39;enzymes (par exemple β-glucosidase, la cellobiohydrolase, NAGase, phosphatases) que l&#39;on peut doser à l&#39;aide de la procédure colorimétrique de NP-substrat p. D&#39;autres enzymes extracellulaires microbiens, tels que la leucine aminopeptidase de la protéine dégradant, peuvent être analysés par fluorimétrie à l&#39;aide de 7-amino-4-méthylcoumarine (CUO) des substrats liés. Les deux MUB et substrats COU-liés ont été utilisés pour déterminer l&#39;activité enzymatique dans divers échantillons terrestres et aquatiques 12,13. Bien que des études antérieures ont descrmicroplaque fluorimétrique ou colorimétrique ibed approches pour déterminer l&#39;activité enzymatique extracellulaire 14, il ya un besoin pour une présentation claire de la façon de mener de tels essais. Ici, nous démontrons les procédures pour la conduite des techniques à haut débit de microplaques pour l&#39;analyse de l&#39;activité enzymatique extracellulaire dans les sols et les sédiments à l&#39;aide de l&#39;approche colorimétrique p substrats de NP-lié et dans les eaux naturelles en utilisant la technique des substrats MUB-Linked Fluorescent. Nous nous concentrons sur la mesure des activités de β-glucosidase, NAGase, et phosphatase que ces enzymes peuvent être liées au carbone, l&#39;azote et le cycle du phosphore, respectivement. Cependant, les modes opératoires décrits ici peuvent être appliqués à la mesure d&#39;autres enzymes extracellulaires en utilisant différents substrats artificiels.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS AND MATERIALS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP612-1</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3234</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7006</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N9376</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Clear 96-well microplates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-563-301</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96-well deep well blocks</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3958</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Aluminum weigh pans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 15 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8883</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3633</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2133</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96-well microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3792</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-81</td>
			<td>For microplates/deep-well blocks</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate fluorometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>FLx 800</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>8-channel pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of microbial extracellular enzyme activity in waters, soils, and sediments using high throughput microplate assays

Une grande partie du cycle des éléments nutritifs et la transformation du carbone en milieu naturel se produit grâce à l&#39;activité des enzymes libérées par les micro-organismes extracellulaires. Ainsi, la mesure de l&#39;activité de ces enzymes extracellulaires peut donner un aperçu des taux de processus au niveau de l&#39;écosystème, telles que la décomposition de la matière organique et la minéralisation de l&#39;azote ou du phosphore. Des dosages de l&#39;activité enzymatique extracellulaire dans des échantillons environnementaux impliquent typiquement l&#39;exposition des échantillons à des substrats colorimétriques ou fluorométriques artificiels et suivant le taux de l&#39;hydrolyse du substrat. Nous décrivons ici microplaques basé méthodes de ces procédures qui permettent l&#39;analyse d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons dans un court laps de temps. Les échantillons sont laissés à réagir avec des substrats artificiels à l&#39;intérieur de microplaques de 96 puits ou de puits profond blocs de microplaques, et l&#39;activité enzymatique est ensuite déterminée par absorption ou de fluorescence du produit final résultant de l&#39;utilisation d&#39;un reade microplaque typiquer ou fluorimètre. Ces procédures à haut débit non seulement de faciliter les comparaisons entre les sites ou les écosystèmes séparés spatialement, mais aussi de réduire sensiblement le coût de ces tests en réduisant les volumes globaux de réactifs nécessaires par échantillon.

Les sols et les sédiments aquatiques ont généralement des niveaux appréciables d&#39;activité enzymatique extracellulaire par suite des communautés microbiennes joints (biofilms) se développant sur ​​la surface des particules. Figure 3 montre comment cette activité varie en fonction de la taille des particules obtenues à partir du sédiment de surface d&#39;une troisième courant de l&#39;ordre dans le nord du Mississippi, États-Unis. Une étude antérieure a montré que les communautés b...

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Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

procédures de microplaques sont décrites pour l&#39;analyse colorimétrique ou fluorimétrique de l&#39;activité enzymatique extracellulaire. Ces procédures permettent l&#39;analyse rapide d&#39;une telle activité dans un grand nombre d&#39;échantillons de l&#39;environnement dans un laps de temps raisonnable.

Détermination de l&#39;activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Research

JoVE Journal

Environment

38.4K vues.  The University of Mississippi.  procédures de microplaques sont décrites pour l'analyse colorimétrique ou fluorimétrique de l'activité enzymatique extracellulaire. Ces procédures permettent l'analyse rapide d'une telle activité dans un grand nombre d'échantillons de l'environnement dans un laps de temps raisonnable. 

Vidéo: Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

À haut débit Fluorometric Mesure de sol Potentiel activités enzymatiques extracellulaires

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Recherche

Environnement

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the biogeochemical drivers of climate change and to the development and evaluation of GHG mitigation strategies based on modulation of landscape management practices. The static chamber-based method described here is based on trapping gases emitted from the soil surface within a chamber and collecting samples from the chamber headspace at regular intervals for analysis by gas chromatography. Change in gas concentration over time is used to calculate flux. This method can be utilized to measure landscape-based flux of carbon dioxide, nitrous oxide, and methane, and to estimate differences between treatments or explore system dynamics over seasons or years. Infrastructure requirements are modest, but a comprehensive experimental design is essential. This method is easily deployed in the field, conforms to established guidelines, and produces data suitable to large-scale GHG emissions studies.

This article showcases the static chamber-based method for measurement of greenhouse gas flux from soil systems. With relatively modest infrastructure investments, measurements may be obtained from multiple treatments/locations and over timeframes ranging from hours to years.

Mesure du flux de gaz à effet de serre provenant des sols agricoles utilisant statiques Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate reduction is used in industrial wastewater treatment to remove large concentrations of sulfate along with the chemical oxygen demand (COD) and heavy metals. The most common approach to the process is with anaerobic bioreactors in which sulfidogenic sludge is obtained through adaptation of predominantly methanogenic granular sludge to sulfidogenesis. This process may take a long time and does not always eliminate the competition for substrate due to the presence of methanogens in the sludge. In this work, we propose a novel approach to obtain sulfidogenic sludge in which hydrothermal vents sediments are the original source of microorganisms. The microbial community developed in the presence of sulfate and volatile fatty acids is wide enough to sustain sulfate reduction over a long period of time without exhibiting inhibition due to sulfide. 
This protocol describes the procedure to generate the sludge from the sediments in an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) type of reactor. Furthermore, the protocol presents the procedure to demonstrate the capability of the sludge to remove by reductive dechlorination a model of a highly toxic organic pollutant such as trichloroethylene (TCE). The protocol is divided in three stages: (1) the formation of the sludge and the determination of its sulfate reducing activity in the UASB, (2) the experiment to remove the TCE by the sludge, and (3) the identification of microorganisms in the sludge after the TCE reduction. Although in this case the sediments were taken from a site located in Mexico, the generation of a sulfidogenic sludge by using this procedure may work if a different source of sediments is taken since marine sediments are a natural pool of microorganisms that may be enriched in sulfate reducing bacteria.

Microbial sulfate reduction is a process of great importance in environmental biotechnology. The success of the sulfidogenic reactors depends among other factors on the microbial composition of the sludge. Here, we present a protocol to develop sulfidogenic sludge from hydrothermal vents sediments in a UASB reactor for reductive dechlorination purposes.

Développement de sulfurogènes boues de sédiments marins et la réduction de trichloroéthylène dans une couverture Réacteur à refoulement de boue anaérobie

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Haut-débit dépistage des Variations récalcitrant dans la biomasse lignocellulosique: Total lignine, la lignine monomères et enzymatique sucre sortie

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Sediment Core Sectioning and Extraction of Pore Waters under Anoxic Conditions

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is built and can be transported to a temporary work space close to field sampling site(s) to facilitate rapid analysis. Cores are extruded into a portable glove bag, where they are sectioned and each 1-3 cm thick section (depending on core diameter) is sealed into 50 ml centrifuge tubes. Pore waters are separated with centrifugation outside of the glove bag and then returned to the glove bag for separation from the sediment. These extracted pore water samples can be analyzed immediately. Immediate analyses of redox sensitive species, such as sulfide, iron speciation, and arsenic speciation indicate that oxidation of pore waters is minimal; some samples show approximately 100% of the reduced species, e.g. 100% Fe(II) with no detectable Fe(III). Both sediment and pore water samples can be preserved to maintain chemical species for further analysis upon return to the laboratory.

A protocol for sectioning sediment cores and extracting pore waters under anoxic conditions in order to permit analysis of redox sensitive species in both solids and fluids is presented.

Sédiments de base Sectionnement et extraction de Pore Waters dans des conditions anoxiques

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

Clean Échantillonnage et analyse de la Rivière et estuariens Waters pour Trace études métalliques

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a considerable subjective judgment from the operator that carries out the test is involved during its performance, which may affect the final result significantly. Different alternative methods have been put forward, but they cannot compete with the standard rolling test in speed, simplicity and cost.
In an earlier study by the authors, a simple method with a simple device to determine the PL was presented (the &#34;thread bending test&#34; or simply &#34;bending test&#34;); this method allowed the PL to be obtained with minimal operator interference. In the present paper a version of the original bending test is shown. The experimental basis is the same as the original bending test: soil threads which are 3 mm in diameter and 52 mm long are bent until they start to crack, so that both the bending produced and its related moisture content are determined. However, this new version enables the calculation of PL from an equation, so it is not necessary to plot any curve or straight line to obtain this parameter and, in fact, the PL can be achieved with only one experimental point (but two experimental points are recommended).
The PL results obtained with this new version are very similar to those obtained through the original bending test and the standard rolling test by a highly experienced operator. Only in particular cases of high plasticity cohesive soils, there is a greater difference in the result. Despite this, the bending test works very well for all types of soil, both cohesive and very low plasticity soils, where the latter are the most difficult to test via the standard thread rolling method.

The traditional standardized test for determining the plastic limit in soils is performed by hand, and the result varies depending on the operator. An alternative method based on bending measurements is presented in this study. This allows the plastic limit to be obtained with a clear and objective criterion.

Un essai de flexion pour la détermination de la limite plastique Atterberg dans les sols

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Extraction et analyse des acides gras des phospholipides microbiens dans les sols

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

Méthodes de rééchantillonnage du sol pour surveiller les changements dans les concentrations chimiques des sols forestiers

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and organiclastic sulfate reduction (OSR) in marine sediments. However, unravelling the complex pyritization sequence is a challenge because of the coexistence of different sequentially formed pyrite phases. This manuscript describes a sample preparation procedure that enables the use of secondary ion mass spectroscopy (SIMS) to obtain in situ &#948;34S values of various pyrite generations. This allows researchers to constrain how SO4-AOM affects pyritization in methane-bearing sediments. SIMS analysis revealed an extreme range in &#948;34S values, spanning from -41.6 to +114.8&#8240;, which is much wider than the range of &#948;34S values obtained by the traditional bulk sulfur isotope analysis of the same samples. Pyrite in the shallow sediment mainly consists of 34S-depleted framboids, suggesting early diagenetic formation by OSR. Deeper in the sediment, more pyrite occurs as overgrowths and euhedral crystals, which display much higher SIMS &#948;34S values than the framboids. Such 34S-enriched pyrite is related to enhanced SO4-AOM at the sulfate-methane transition zone, postdating OSR. High-resolution in situ SIMS sulfur isotope analyses allow for the reconstruction of the pyritization processes, which cannot be resolved by bulk sulfur isotope analysis.

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Analyses of the sulfur isotopic composition (&#948;34S) of pyrite from methane-bearing sediments have typically focused on bulk samples. Here, we applied secondary ion mass spectroscopy to analyze the &#948;34S values of various pyrite generations to understand the diagenetic history of pyritization.