Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.

1. ARNr 16S Gene Amplicon Bibliothèque préparation par la méthode de fusion <ol><li> Décongeler les amorces (à terme, F343-Iona-MIDXX: 5 &#39;CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT GCC AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3&#39;, à l&#39;inverse, R533-IonP1: 5&#39;-CCT CCT TAT GGG CAG TCG GTG AT A TTA GCC CGG CTG CTG GC-3 &#39;; gras: adaptateurs spécifiques Ion torrent; italique: clé de séquencement pour calibrer l&#39;intensité du signal au début de la course au séquençage; police régulière: amorces spécifiques de modèle; X ... X: 10 pb code à barres, voir le tableau 1 pour certaines séquences de codes à barres), le master mix 2x HotStartTaq Plus et les échantillons. Bien mélanger avant utilisation, à l&#39;exception du mélange maître qui doivent être mélangés doucement. </li><li> Préparer un mélange de PCR (20 ul de réaction) avec 0,5 uM de l&#39;amorce inverse, 0,4 mg / ml de Sérum Albumine Bovine (BSA) et 1x HotStartTaq plus de mélange maître. Ajouter 18,5 ul du mélange maître à l&#39;eTube ach PCR. </li><li> Ajouter une amorce directe (0,5 ul de 20 mM) avec un code à barres différent pour chacun des échantillons qui seront séquencés ensemble. Ajouter 1 ul d&#39;échantillon (1-10 ng / ul) au tube PCR. </li><li> Placer les tubes dans une machine PCR et exécuter le programme suivant: dénaturation initiale à 95 ° C pendant 5 min; 25 cycles de 95 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 sec et 72 ° C pendant 45 s; allongement final à 72 ° C pendant 10 min. Les produits de PCR peuvent être conservés à 4 ° CO / N ou congelés jusqu&#39;à leur utilisation. </li></ol> 2. Amplicon purification, la quantification et la mise en commun <ol><li> Préparation d&#39;un gel d&#39;agarose à 2% à l&#39;aide des plus grands peignes disponible. Ajouter 5 ul de gel de 6x colorant de charge à la réaction et de la charge sur le gel, en séparant chaque échantillon par un puits vide. Exécutez le gel à 70 V pendant 50 min. </li><li> Prenez une photo du gel et couper les bandes (taille attendue d&#39;environ 250 pb: produit de pb 190, plus 63 cartes de pb et codes à barres) à l&#39;aide d&#39;un scalpel propre. </li><li&gt; Peser les bandes excisées et procéder à l&#39;extraction de gel et la purification des produits de PCR (avec, par exemple, un kit d&#39;extraction de gel Qiaquick). </li><li> Quantifier chaque produit PCR avec PicoGreen et faire des dilutions pour obtenir une solution mère à 5 x 10 9 molécules / ul (environ 1 ng / pl). Si certains échantillons montrent une amplification plus faible, ajustez les dilutions à une concentration plus faible, en gardant à l&#39;esprit que la plus faible concentration appropriée pour les procédures ultérieures est de 1,57 x 10 7 molécules / ul (26 heures). </li><li> Piscine 10 pi de chaque produit de PCR dilué pour obtenir une piscine équimolaire d&#39;échantillons. Préparer un bassin séparé pour chacun de la course de séquençage prévu. Les produits de PCR peuvent être regroupées conservés au congélateur jusqu&#39;à leur utilisation. </li></ol> 3 Emulsion PCR et séquençage <ol><li> Faire la PCR en émulsion: <ol><li> Diluer les produits épreuve à 26 pM dans un volume de 25 pi. Réactifs dégel à partir d&#39;un kit de modèle Ion PGM. </li><li> Préparer le mélange PCR en émulsion (réactifs fournis dans le kit) dans une hotte PCR et ajouter les produits de PCR en gestion commune et les particules sphériques (fournies) sur le banc. Bien mélanger et insérez le mélange dans une cartouche filtrante et le haut soigneusement avec de l&#39;huile d&#39;émulsion (fourni). </li><li> Inverser doucement la cartouche de filtre et de la charge sur l&#39;appareil de PCR en émulsion automatisé (par exemple, une touche Ion instrument 2). Sélectionnez le programme approprié et lancer la procédure. </li></ol></li><li> Après la PCR automatisé émulsion est terminée, enlever le surnageant des tubes de collecte et de récupérer les particules sphériques au fond des tubes. Remettre en suspension les sphères dans 100 pi de solution de lavage (fourni dans le kit) et prendre une aliquote de 2,0 pl pour la bibliothèque quantification. </li><li> Effectuer la bibliothèque quantification. <ol><li> Mélanger 100 pi de tampon SSPE (150 mM de NaCl, 10 mM NaPO 4, 1 mM Na 2 EDTA) avec 2 pl de l&#39;adaptateur B&#39;-Fam (5&#39;-FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 &#39;) sonde et 2 pi de la carte A-Cy5 (5&#39;-Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT GCC LOI CAG-3&#39;) sonde. Ajouter 52 ul de ce mélange à l&#39;aliquote de 2,0 ul pris à l&#39;étape 3.2 et ajouter 2 pi de solution de lavage (à partir du kit de modèle) pour les 52 pi restants comme un blanc pour la quantification. </li><li> Incuber à 95 ° C pendant 2 min, puis à 37 ° C pendant 2 min. Transférer les mélanges en tubes de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 1,0 ml de tampon de TEX (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, 0,01% de Triton X-100, pH 8,0), mélanger et centrifuger à 15 500 g pendant 3 min à température ambiante. Enlever le surnageant et laisser 20 pi dans chaque tube. Répéter ce procédé de lavage à deux reprises. </li><li> Ajouter 180 ul de tampon de TEX, remettre en suspension les particules granulées et transférer dans 500 tubes ul Qubit. </li><li> Mesurer la fluorescence de la FAM et Cy5 en utilisant un appareil de qubits, et calculer le rapport de sphères positifs en utilisant le calculateur disponible sur le site Ion Communauté. </li></ol></li><li> Enrichir le reste des particules sphériques de sphères positives (contenant de l&#39;ADN amplifié) en utilisant un système d&#39;enrichissement automatisé (par exemple, un système d&#39;enrichissement Ion Touch). <ol><li> Réactifs pipette dans les puits appropriés de la condition bande de 8 puits: Puits 1: particules sphériques de l&#39;étape 3.2; Eh bien 2: pré-lavés perles MyOne streptavidine C1 (13 pi); Eh bien 3, 4 et 5: solution de lavage (fourni dans le kit de modèle); Eh bien 6: vide; Eh bien 7: fusion de solution (NaOH 125 mM, 0,1% de Tween 20); Eh bien 8: vide. </li><li> Installez une astuce sur le bras de pipetage et un tube de 0,2 ml pour la collecte de l&#39;échantillon. Lancer l&#39;instrument. A la fin de l&#39;enrichissement, ajouter 10 ul de solution (fourni) à neutraliser. Les perles enrichies peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 15 jours. </li></ol></li><li> Initialiser l&#39;instrument de séquençage: <ol><li> Connectez-vous à l&#39;instrument de séquençage et de préparer un plan séquence de l&#39;exécution, en précisant les détails de la course de séquençage. </li><li> Installerl de la solution de lavage n ° 2 (fourni dans le kit de séquençage Ion PGM), la solution de lavage n ° 1 (350 ul de NaOH à 100 mM) et la solution tampon de pH automatique (fourni). </li><li> Commencez la procédure d&#39;initialisation et lorsque vous êtes invité ajouter le dATP, dCTP et dGTP nucléotides dTTP (fourni) dans leurs tubes de 50 ml respectifs. Visser les tubes sur la machine de séquençage et poursuivre la procédure d&#39;initialisation. Lorsque l&#39;initialisation est terminée, lancer la procédure d&#39;exécution immédiatement. </li></ol></li><li> Préparer les échantillons pour le séquençage et charger la puce: <ol><li> Recueillir les sphères enrichies provenant de l&#39;étape 3.4 dans le bas du tube par centrifugation à 15 500 xg pendant 1,5 min. Eliminer le surnageant en laissant exactement 3 pl. </li><li> Ajouter 3 pi de amorce de séquençage (fourni dans le kit de séquençage), bien mélanger par pipetage de haut en bas pour remettre en suspension les particules. Incuber à 95 ° C pendant 2 min, puis à 37 ° C pendant 2 min. </li><li> Ajouter 1 pl de polymerase (fourni), bien mélanger et Incubmangé à température ambiante pendant 5 min. Procéder à charger le mélange enzyme-sphère sur la puce de séquençage dans les 30 min. </li><li> Pendant l&#39;incubation, charger la puce de séquençage sur le séquenceur et effectuer un contrôle de la qualité des copeaux. Retirer le liquide à partir de la puce par centrifugation et charger l&#39;échantillon dans la puce par pipetage vers le bas lentement le mélange enzyme-sphère (7 pi) et d&#39;éviter l&#39;introduction de bulles dans la puce. </li><li> Centrifuger la puce trois fois pendant 1 minute dans une microcentrifugeuse. Changez l&#39;orientation de la puce à chaque centrifugation et mélanger par pipetage de haut en bas entre chaque course. </li><li> Charger la puce dans l&#39;appareil et commencer la course. </li></ol></li></ol> Analyse des données de séquence de base 4 <ol><li> Connectez-vous au serveur de données de séquençage et télécharger le fichier fastq. Créer un &quot;oligos&quot; fichier délimité par des tabulations contenant l&#39;amorce et code à barres informations (voir l&#39;exemple dans le tableau 1). Télécharger les fichiers de référence Greengenes du Motsite hur ( <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline</a> ). </li><li> Lancez mothur et effectuer des analyses: <ol><li> Convertir le fichier fastq à un fasta et un fichier de qualité en utilisant la commande suivante: fastq.info (fastq = test.fastq) </li><li> Déterminer l&#39;appartenance au groupe de chaque séquence et couper les séquences en utilisant la commande suivante: trim.seqs (fasta = test.fasta, oligos = barcode.txt, QFile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minlength = 150, keepforward = T) </li><li> Les différentes options peuvent être modifiées en fonction de la rigueur souhaitée </li><li> Classer les séquences dans le greengenes taxonomie en utilisant la commande suivante: classify.seqs (fasta = test.trim.fasta, method = wang, groupe = test.groups, template = gg_99_otus.fasta, taxinomie = gg_99_otus.tax, coupure = 50) </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

<html> La méthode présentée ici est simple et peu coûteux, et devrait permettre à de nombreux laboratoires d&#39;accéder à la puissance de séquençage métagénomique. Bien qu&#39;il varie en fonction de la plate-forme de séquençage utilisée, une fois que les bibliothèques sont construites sont nécessaires très peu de mains sur le temps, avec la plupart des processus étant automatisés. Pour la plate-forme de séquençage utilisée ici (Ion Torrent PGM), la procédure complète peut être effectuée dans les deux jours de travail. Au moment de l&#39;écriture (Septembre 2013), les coûts des réactifs liés à l&#39;exemple détaillé ci-dessus ont été les suivantes: amplification par PCR de 36 échantillons: 25 $, la purification sur gel et PicoGreen ADN quantification de 36 échantillons: 125 $, émulsion PCR pour un échantillon d&#39;amplicon groupé : 150 $ et réactifs de séquençage: 250 $, pour un total de 550 $ ou 15 $ par échantillon ou $ 0,0015 par lecture de qualité filtré. Ce prix ne comprend pas de contrat instrument de service, l&#39;amortissement de l&#39;instrument, technicien salaire et utilisation de l&#39;espace de laboratoire. tente &quot;&gt; Une des étapes les plus importantes est de mettre en commun tous les produits dans un rapport équimolaire, afin de récupérer le même nombre de lectures pour chacun des échantillons. PicoGreen quantification a été utilisé ici, mais d&#39;autres méthodes pourrait être approprié, bien que moins précise (par exemple, la quantification UV, la quantification à base de gel). Même en faisant la quantification plus précise et la mise en commun, il ya une certaine variabilité dans le nombre de lectures par exemple, et à l&#39;approche typique détaillées au tableau 2, il varie de 4380 à 32750 lit, avec une moyenne de 10 338 lit. Si le traitement grand nombre d&#39;échantillons (plus de 40-50), la purification de gel unique de la colonne peut être remplacée par une purification sur gel en plaque ou de purification en utilisant des billes avec une coupure de taille strictes (par exemple, des perles AMPure) . À ce jour, la technologie de séquençage le plus utilisé de la prochaine génération pour le gène de l&#39;ARNr 16S est 454. Le Ion Torrent technologie de séquençage utilisée dans ce protocole est conceptuellement très similaireà 454 et les deux techniques sont sujettes à la même type d&#39;erreurs de séquençage. Sans surprise, il a été montré que le séquençage Ion Torrent a abouti à des résultats de séquençage très similaires à 454 séquençage 10. Récemment, de nombreux chercheurs ont exploré l&#39;utilisation de la technologie Illumina pour l&#39;ARNr 16S amplicon du gène séquençage 18,19. En tout cas, il serait facile d&#39;adapter le protocole en vigueur pour d&#39;autres séquenceurs de paillasse comme le Illumina MiSeq ou la 454 GS junior en changeant les séquences de fusion des amorces de faire correspondre les cartes et les codes à barres nécessaires à ces technologies de séquençage, comme dans le procédé décrit récemment pour la Illumina MiSeq 19. Alternativement, les chercheurs ont pu suivre les étapes 1 et 2 du protocole détaillé ici et envoyer les amplicons communs à un centre de séquençage où l&#39;émulsion PCR et séquençage seraient effectuées. Le gène de l&#39;ARNr 16S lectures ont été coupé et classé à l&#39;aide mothur, mais beaucoup d&#39;autres analyses peuvent être effectuées surAmplicons du gène ADNr 16S. Par exemple, la diversité bêta peut être évaluée en calculant les distances entre chaque paire Unifrac de l&#39;échantillon à l&#39;aide de la procédure décrite à <a href="http://unifrac.colorado.edu/">http://unifrac.colorado.edu/</a> 20. Alpha indices de diversité et le nombre d&#39;unités taxonomiques opérationnelles de chaque échantillon peuvent être calculées à l&#39;aide des outils dans QIIME comme AmpliconNoise 21 ou en utilisant la procédure décrite par Huse et al. 22 et disponible dans mothur. Les amorces utilisées ici amplifiés les régions variables 3 et 4 du gène de l&#39;ARNr 16S, mais beaucoup d&#39;autres régions pourraient être ciblés. Dans cette étude, les gènes de l&#39;ARNr 16S ont été amplifiés à partir de la matière végétale et le choix de l&#39;amorce ont été faits pour éviter l&#39;amplification du gène de l&#39;ARNr 16S du chloroplaste 23,24. Il existe une grande variété d&#39;autres amorces disponibles qui varient selon la durée de la longueur du produit, la puissance et l&#39;utilité taxonomique 25,26. Cependant, dans tous les cas 200-400 pb lit du gène ARNr 16S ne peut pas être fiable classés au niveau de l&#39;espèce, et les analyses sont limitées au genre et les niveaux taxonomiques plus élevés. D&#39;autres gènes pourraient être plus approprié si l&#39;information au niveau des espèces est nécessaire, comme les cpn60 et rpoB gènes 27,28. Une chute brutale à venir dans le coût du séquençage et l&#39;augmentation de la puissance des outils d&#39;analyse pourrait rendre possible de remplacer le séquençage du gène 16S ARNr par métagénomique fusil de chasse, mais en attendant, le séquençage du gène 16S ARNr reste la norme de microbiologie environnementale de l&#39;or.

Séquençage métagénomique est une technologie très puissante car il vise l&#39;ensemble de l&#39;information génétique contenue dans un échantillon environnemental. Il ya différentes saveurs de séquençage métagénomique, y compris le séquençage de fusil de chasse, les bibliothèques de grande insertion et le séquençage de l&#39;amplicon. le séquençage de l&#39;amplicon offre l&#39;avantage d&#39;être relativement peu coûteux, rapide et capable de produire des lectures d&#39;une région génomique unique qui peut être généralement alignée. En outre, le flux de données pour l&#39;analyse de séquençage de l&#39;amplicon a été normalisé. Cependant, puisqu&#39;il est basé sur la PCR, il a tous les biais liés à la spécificité incomplète, couverture incomplète et amorce sollicite 1,2, ce qui rend cette approche semi-quantitative au mieux. Plusieurs régions génomiques peuvent être ciblés pour le séquençage de l&#39;amplicon y compris les gènes fonctionnels, mais les options les plus populaires sont d&#39;utiliser des gènes marqueurs tels que le gène de l&#39;ARNr 16S pour générer un profil de communauté. Traditionnellement, l&#39;ARNr 16S gène amplicon Sequencing a été réalisée en utilisant des techniques à forte intensité de main-d&#39;œuvre qui comprenait le clonage dans E. coli, la cueillette et l&#39;extraction des colonies de plasmide suivie d&#39;un séquençage Sanger sur les plasmides isolés, et, par conséquent, la plupart des études analysé moins de 100 clones par échantillon. Séquençage de nouvelle génération a apporté deux avancées majeures: la parallélisation massive des réactions de séquençage et, surtout, la séparation clonale des modèles sans avoir besoin d&#39;insérer des fragments de gènes dans un hôte. Cela a simplifié considérablement le séquençage d&#39;amplicons du gène ADNr 16S, qui est maintenant de retour en tant que caractéristique courante de nombreuses études de microbiologie de l&#39;environnement, résultant en une «renaissance» pour l&#39;ARNr 16S amplicon du gène séquençage 3. Depuis l&#39;avènement de Roche 454 séquençage en 2005 4, plusieurs autres technologies de séquençage de nouvelle génération sont apparus sur le marché (par exemple, Illumina, solide, PacBio). Plus récemment, l&#39;introduction de la séquence de paillassers portées à petits laboratoires de la capacité de séquençage fois exclusif de grands centres de séquençage. Cinq machines stationnaires sont actuellement disponibles: la 454 GS Junior Ion Torrent Personal Genome automatique (PGM) et Proton, et l&#39;Illumina MiSeq et NextSeq 500 Bien que toutes ces séquenceurs offrent moins de lectures par cycle et moins de bases pour chaque dollar que la plupart à temps plein séquenceurs d&#39;échelle, ils sont plus souples, rapides, et leurs coûts d&#39;acquisition et d&#39;exploitation à basse rend abordable pour les petits laboratoires universitaires. Séquenceurs de paillasse sont particulièrement bien adaptés pour amplicon, petit génome et à faible complexité séquençage du métagénome dans les études de microbiologie de l&#39;environnement, parce que ce type d&#39;études ne nécessite généralement pas la profondeur extrême de séquençage. Par exemple, il est généralement admis que pour le séquençage du gène 16S ARNr étudie le nombre de lectures par échantillon n&#39;est pas primordiale, comme ~ 1000 la lecture peut générer les mêmes schémas que plusieurs millions de lectures ensembles de données 5. Cela dit, paillasse prochaine generatio<html> n séquenceurs génèrent encore de grandes quantités de données de séquence, avec des rendements maximaux de ~ 35 Mbp (454 GS Junior), ~ 2 Gbp (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (Ion Torrent Proton), ~ 10 Gbp (Illumina MiSeq) et ~ 100 GBP (Illumina Suivant Seq 500), ce qui est plus que suffisant pour la plupart des études de microbiologie de l&#39;environnement. Séquençage de nouvelle génération d&#39;amplicons d&#39;ARNr 16S à l&#39;aide de séquenceurs de paillasse a été récemment appliquée à une grande variété d&#39;environnements. Par exemple, la Ion Torrent PGM a été utilisé pour la communauté des analyses de résidus des mines d&#39;uranium qui avaient particulièrement un pH élevé et une faible perméabilité 6, de systèmes de recirculation de l&#39;aquaculture 7, de sols arctiques contaminés par des hydrocarbures 8,9, de sables bitumineux miniers sédiments touchés et biofilms de la rivière Athabasca 10,11, de la rhizosphère de saules plantés dans des sols contaminés 12, des corps humains et animaux 13-16 et de 17 des digesteurs anaérobies. jove_content &quot;&gt; Dans cette contribution, nous détaillons notre approche de séquençage de l&#39;ARNr 16S amplicons de gènes en interne à l&#39;aide d&#39;une paillasse séquenceur de nouvelle génération (la Ion Torrent PGM). Après extraction de l&#39;ADN, les gènes ARNr 16S sont amplifiés en utilisant des amorces bactériennes au niveau du domaine qui contiennent adaptateurs de séquençage et des séquences uniques, spécifiques à l&#39;échantillon (codes à barres). Les amplicons sont purifiés, quantifiées et regroupées dans un rapport équimolaire. Les échantillons mis en commun puis clonage amplifiés dans une émulsion PCR et séquencés. séquences qui en résultent sont analysés en utilisant la disposition du public des outils de bioinformatique ( par exemple, mothur).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion 314 Chip Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482261</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Sequencing 200 Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482006</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Template OT2 200 Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4480974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq Plus Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>203646</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers and probes</td>
			<td style="width:145px;">IDT</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA 20 mg/ml</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10,711,454,001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

next-generation sequencing of 16s ribosomal rna gene amplicons

L&#39;une des grandes questions de l&#39;écologie microbienne est &quot;qui est là?&quot; Cette question peut être répondue en utilisant divers outils, mais l&#39;une des règles d&#39;or de longue durée est de séquencer amplicons 16S ARN ribosomique (ARNr) de gènes générées par PCR au niveau du domaine Les réactions d&#39;amplification de l&#39;ADN génomique. Traditionnellement, cela a été réalisé par clonage et Sanger (électrophorèse capillaire) séquençage des amplicons PCR. L&#39;avènement de séquençage de nouvelle génération a énormément simplifié et une augmentation de la profondeur de séquençage pour le séquençage du gène de l&#39;ARNr 16S. L&#39;introduction de séquenceurs de paillasse permet maintenant de petits laboratoires à effectuer leur séquençage 16S de l&#39;ARNr en interne dans une affaire de jours. Ici, une approche pour l&#39;ARNr 16S séquençage de l&#39;amplicon du gène en utilisant une paillasse de séquenceur de nouvelle génération est détaillé. L&#39;ADN de l&#39;environnement est d&#39;abord amplifié par PCR en utilisant des amorces qui contiennent des adaptateurs de séquençage et des codes barres. Ils sont ensuite couplés à des particules sphériques émulsion via PCR. Les particules sont de loaded sur une puce jetable et la puce est insérée dans la machine de mise en séquence, après quoi le séquençage est effectué. Les séquences sont récupérés sous forme fastq, filtrées et les codes à barres sont utilisés pour déterminer la composition des échantillons du lit. Le filtré et mis en cellule lectures sont ensuite analysées en outre l&#39;utilisation des outils accessibles au public. Une analyse de l&#39;exemple où lectures ont été classés avec un algorithme de taxonomie trouver dans le logiciel mothur est donnée. La méthode décrite ici est simple, peu coûteux et simple et devrait aider les petits laboratoires de profiter de la révolution génomique en cours.

Après purification sur gel, avec 25 cycles d&#39;amplification par PCR, les produits d&#39;amplification sont en général à une concentration de 0,2 à 10,0 ng dans 50 ul d&#39;eau. Cela peut varier largement en fonction de la concentration de l&#39;ADN de départ, le type d&#39;échantillon et le kit de purification utilisée. Il est recommandé de maintenir le nombre de cycles de PCR à la plus faible possible pour éviter la formation de chimère et de diminuer les biais d&#39;amplification, en gardant à l&#39;esprit que tous les échantillons doivent être amplifiés en utilisant le même nombre de cycles. Pour réduire le nombre d&#39;anticorps polyclonaux les lectures et les sphères vides et maximiser le nombre de lectures, le rapport de qubits doit être comprise entre 0,1 et 0,3 et la fluorescence de la FAM doit être supérieure à 200 l&#39;aide d&#39;une puce 314 sur un Ion Torrent PGM, le rendement moyen est de l&#39;ordre 0,3-0,5 M de bonne qualité lit après filtrage des résultats en mothur. tableau 2 présente la répartition typique du nombre de lectures après chaque étape de la procédure pour une course contenant 36 environ multiplexééchantillons mentale amplifiés avec des amorces ciblant la région V3-4 des 16S et analysées à l&#39;aide mothur. Dans mothur, la procédure de trim.seqs générer un fichier &quot;* de .trim.fasta&quot; contenant les séquences qui ont passé les filtres de qualité et un &quot;* .scrap.fasta&quot; qui contient les séquences qui ne passe pas les filtres de qualité ainsi que la raison de rejet dans l&#39;en-tête de séquence. Lorsque fourni avec des codes à barres dans le &quot;oligos&quot; fichier, cette commande génère également un fichier &quot;* .Groupes&quot; qui contient l&#39;appartenance au groupe de chaque séquence basée sur la séquence de codes à barres. La procédure de classify.seqs génère un &quot;.tax.summary&quot; qui peut être ouvert dans Excel. Ce fichier contient le résumé de l&#39;affiliation taxonomique (en lignes) pour chacun des échantillons (en colonnes). Ce fichier peut être utilisé pour les analyses statistiques en aval et de visualiser la composition de la communauté à différents niveaux taxonomiques. Le fichier &quot;.taxonomy&quot; contient la taxonomie détailléeaffiliation pour chaque séquence. La composition de la communauté moyenne au niveau phylum / classe dans tous les 36 échantillons est illustré à la figure 1. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1 composition de la communauté moyenne au niveau phylum / classe dans tous les échantillons. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> avant </td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> code à barres </td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> code à barres </td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr height = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;"> code à barres </td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> code à barres </td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> code à barres </td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Leçon05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> code à barres </td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Sample06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> code à barres </td><td> TTCGTGATTC </td><td> Leçon07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> code à barres </td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> code à barres </td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> code à barres </td><td> CTGACCGAAC </td><td> Leçon10 </td></tr></tbody></table> Tableau 1 Exemple &quot;oligos&quot; fichier pour une utilisation dans mothur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> Nombre de lit </td><td style="width:123px;"> % De l&#39;étape précédente </td><td style="width:107px;"> Moy. Par exemple </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Nombre de puits </td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Wells avec des perles </td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88.20% </td><td align="center"> 30947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Perles avec des modèles </td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99,90% </td><td align="center"> 30910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Perles monoclonaux </td><td align="center"> 826805 </td><td align="center"> 74.30% </td><td align="center"> 22967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Bonne qualité lit (sortie du séquenceur) </td><td align="center"> 782204 </td><td align="center"> 94.60% </td><td align="center"> 21728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Passe mothur filtres (min. Moy. Score de qualité de 20 sur une fenêtre de 50 points de base, min. Longueur de 150 points de base) </td><td align="center"> 372168 </td><td align="center"> 47.60% </td><td align="center"> 10338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classé au niveau de l&#39;embranchement en GreenGenes (50% seuil de confiance) </td><td align="center"> 342171 </td><td align="center"> 91.90% </td><td align="center"> 9505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classé au niveau de la famille dans GreenGenes (50% seuil de confiance) </td><td align="center"> 316512 </td><td align="center"> 92.50% </td><td align="center"> 8792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classé au niveau du genre dans GreenGenes (50% seuil de confiance) </td><td align="center"> 289899 </td><td align="center"> 91.60% </td><td align="center"> 8053 </td></tr></tbody></table> Tableau 2 Nombre de lectures produites à partir d&#39;un essai typique pour 36 échantillons environnementaux multiplexés sur une puce Ion Torrent 314.

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Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

La nouvelle génération de séquençage de l&#39;ARN ribosomal 16S gènes amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

next-generation-sequencing-of-16s-ribosomal-rna-gene-amplicons

Research

JoVE Journal

Biology

83.0K vues.  National Research Council Canada. Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer. 

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Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Fluorescence microscopie dépistage et séquençage de prochaine génération: des outils utiles pour l&#39;identification des gènes impliqués dans des organites intégrité

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Recherche

Biologie

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

L&#39;appauvrissement de l&#39;ARN ribosomique pour métagénomique Gut Mosquito ARN-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Ciblé méthylation de l&#39;ADN Analyse par séquençage de nouvelle génération

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

L&#39;extraction d&#39;acide nucléique et efficace de l&#39;ARNr 16S bactérien pour Séquençage génique communautaire Caractérisation

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Ciblées ARN Séquençage Assay pour caractériser l&#39;expression génique et génomique Transformations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Protocole de guidée pour la caractérisation microbienne fécale par 16 s rRNA-Amplicon séquençage

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Tique Microbiome caractérisation par génération 16 s rRNA Amplicon séquençage

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

Un protocole d’extraction de l’ADN des moustiques à base de perles magnétiques pour le séquençage de nouvelle génération

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...