Les nucléosides et les nucléotides sont des composants métaboliques centraux dans tous les organismes vivants. Le métabolisme d’entre eux est nécessaire pour le développement cellulaire. Cette approche fournit un outil puissant pour la quantification de ces métabolites.
Cette méthode permet une quantification rapide et précise des nucléosides et des nucléotides dans les plantes. Les prétr traitements complets des échantillons et les analyses LC-MS/MS prennent environ deux jours pour une série de 10 à 20 échantillons. Cette méthode peut être appliquée à toutes les plantes et même à d’autres organismes.
Changhua Zhu, professeur agrégé du Laboratoire Chen, fera la démonstration de la procédure. Pour faire pousser les plantes, assurez-vous que les graines d’Arabidopsis sont stérilisées dans de l’éthanol à 70% pendant 10 minutes et semées sur des plaques de gélose avec 1/2 de force murashige et Skoog nutriments. Incuber les plaques dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant 48 heures, puis les transférer dans une chambre de croissance contrôlée sous 16 heures de lumière à 22 degrés Celsius et huit heures d’obscurité à 20 degrés Celsius.
Récoltez 100 milligrammes de semis de deux semaines et congelez-les dans de l’azote liquide pour l’extraction des métabolites. Broyer 100 milligrammes de tissus végétaux congelés avec sept à huit billes d’acier dans un mélangeur pré-refroidi pendant cinq minutes à une fréquence de 60 Hertz. Préparer la solution d’extraction, qui contient du méthanol, de l’acétonitrile et de l’eau dans un rapport de deux à deux pour un.
Ressusciter les matériaux homogénéisés avec un millilitre de la solution d’extraction. Centrifuger la solution résultante à 12 000 XG pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis transférer 0,5 millilitres de la suspension dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et le congeler dans de l’azote liquide. Évaporer l’échantillon congelé dans un lyophilisateur et le remettre en suspension dans 0,5 millilitre d’acétonitr à 5 % et à 95 % d’eau.
Centrifuger la solution obtenue à 4 000 XG pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Chargez le surnageant dans un flacon pour la mesure LC-MS/MS. Préparer un tampon acétate d’ammonium de 10 millimolaires en dissolvant 1,5 gramme d’acétate d’ammonium dans deux litres d’eau double désionisée.
Ajuster le pH à 9,5 avec 10% d’ammonium et d’acétate d’acide. Préparez deux litres d’ultrapure 100% méthanol pour la mesure des nucléosides, puis préparez deux litres d’acétonitrile ultrapur pour la mesure des nucléotides. Injecter 0,02 millilitres de l’extraction de métabolite prétraité de chaque échantillon précédemment préparé dans un système HPLC avec des pompes binaires couplées à un spectromètre de masse triple quadruple.
Pour générer les courbes d’étalonnage standard, regroupez six extractions d’échantillons et vortex le mélange, puis aliquotez-le à six extractions à nouveau pour obtenir chaque fond. Ajoutez six concentrations différentes de chaque étalon à ces six extractions respectivement et injectez-les une par une dans le système HPLC. Enregistrez les zones de pointe de chaque étalon à différentes concentrations via les transitions de masse.
Ce protocole a été employé pour identifier et quantifier N1-methyladenosine, un nucléoside modifié connu, dans des semis de type sauvage d’Arabidopsis vieux de deux semaines. Le profil de spectrométrie de masse a indiqué que les ions produits générés à partir de la norme N1-méthyladénosine sont à des rapports de 150 et 133 MZ. Et le même profil a été observé dans l’extraction zéro colombie.
En raison de la grande abondance de l’ion produit de 150 MZ, la transition de masse de 282,1 à 150 a été sélectionnée pour l’identification de la N1-méthyladénosine. Le temps de rétention du pic cible était de 7,05 minutes. Identique au temps de rétention de la norme N1-méthyladénosine.
Une série de concentrations de normes de N1-méthyladénosine a été ajoutée dans six extractions d’échantillons. Les échantillons types ont été injectés dans la LC-MS/MS et les zones de pointe accrues de N1-méthyladénosine ont été tracées par rapport aux concentrations nominales des étalons. Les six extractions de fond égales sont importantes pour créer une courbe d’étalonnage précise et reproductible pour la quantification.
Notre méthode peut être appliquée pour explorer les voies métaboliques chez les plantes. En comparant les profils de métabolite entre les mutants de type sauvage et de perte de fonction, le flux métabolique a pu être dessiné.
