La lignine est un hétéropolymère complexe composé de trois monolignols. C’est le deuxième polymère le plus abondant sur terre après la cellulose. Ici, nous démontrons la méthode de l’acide thioglycolique, qui est la méthode la plus fiable pour l’estimation de la teneur en lignine.
Cette méthode est basée sur le principe que la lignine se lie à l’acide thioglycolique par des liaisons thioéther. De plus, nous avons divisé ce protocole en cinq phases. Dans la première phase, nous préparons le matériel végétal.
Dans la deuxième phase, nous isolons l’extrait insoluble dans l’alcool. Dans la troisième phase, nous précipitons la lignine en utilisant de l’acide thioglycolique et des conditions acides. Dans la quatrième phase, nous préparons la courbe standard de la lignine en utilisant de la lignine de bambou industrielle.
Enfin, dans la cinquième phase, nous estimons la teneur en lignine à l’aide de la courbe standard préparée dans la quatrième phase. Le matériel végétal est collecté, retourné les pots pour séparer les racines, lavé à fond à l’eau, séché à l’air pendant deux jours, transféré dans des récipients étiquetés et incubé dans l’incubateur à 49 degrés centigrades pendant une semaine à 10 jours. À l’aide de ciseaux, le tissu est ensuite coupé en morceaux de taille 1 mm à 3 mm.
Alternativement, un broyeur à biomasse est utilisé pour écraser les tissus végétaux. Utilisez le tissu racinaire Allumez le broyeur à biomasse collectez la poudre broyée dans des récipients pré-étiquetés. De même, répétez pour le tissu de la tige et le tissu foliaire.
La poudre broyée est chargée dans le vase de broyage qui est ensuite placé dans le congélateur et faire fonctionner le congélateur à raison de 10 CP vitesse pendant trois cycles. Peser 20 mg de la poudre de tissu moulu et transférer dans un tube préfammé de 2ml. Prenez note du tube vide et du tube contenant de la poudre de tissu et de la poudre de tissu dans votre cahier de laboratoire.
Incuber les tubes avec capuchon ouvert à 60 degrés centigrades pendant une heure. Après incubation, ajouter 1,8 ml d’eau à chaque centrifugeuse à vortex de l’échantillon à 15 000 tr/min pendant 10 minutes. Jeter le surnageant Ajouter 1,8 ml de méthanol.
Vortex et incuber dans un bloc centigrade préchauffé de 60 degrés pendant 20 minutes Après centrifugeuse d’incubation à 15 000 rpm pendant 10 minutes. Répétez cette étape une fois de plus. Après centrifugation, jetez le surnageant et séchez les granulés dans le séchoir à vide pendant deux à trois heures ou jusqu’à ce que la palette soit complètement sèche.
Mesurez et enregistrez le poids de chaque tube dans votre cahier de laboratoire pour l’estimation de la teneur en lignine à la fin. Incluez également la lignine de bambou industrielle à contrôle positif à ce stade à partir de 0,5 mg à 4 mg en triple exemplaires. Ajouter 1 ml de 3 acides chlorhydriques normaux, ainsi que cent microlitres d’acide glycolique à chaque échantillon de Vortex et incuber à 80 degrés centigrades pendant 3 heures.
Après 3 heures d’incubation, transférez-les dans un rack et laissez-le refroidir pendant 10 minutes. puis centrifuger à 15 000 tr/min pendant 10 minutes. Après centrifugation, la couleur de la solution ressemble à ceci.
Jetez le surnageant. Ajouter 1 ml d’eau. Centrifugeuse à vortex à 15 000 tr / min pendant 10 minutes.
Jetez le surnageant. Ajouter 1 ml de 1 hydroxyde de sodium normal. Vortex et incuber à 37 degrés centigrade shaker pendant la nuit.
Après une nuit d’incubation centrifuger les tubes à 15 000 tr / min pendant 10 minutes. Transférer le surnageant frais pré-marqué de 2 ml tubes ajouter 200 microlitres d’acide chlorhydrique concentré au surnageant. Mélangez-les par inversion douce comme indiqué ici.
Incuber dans le réfrigérateur à 4 degrés centigrades pendant la nuit. Après centrifugeuse d’incubation à 15 000 tr/min pendant 10 minutes. Jetez le surnageant.
Ajouter 1 ml d’hydroxyde de sodium. Vortex et incuber dans le shaker à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Utilisez le spectrophotomètre pour recueillir les lectures d’absorbance 280 nanomètres, Prenez 2 microlitres d’hydroxyde de sodium à blanc puisque la lignine précipitée est dissoute dans l’hydroxyde de sodium.
Faites en sorte que le blanc soit égal à zéro. De même, répétez l’opération pour les échantillons. Utilisez deux microlitres de chaque échantillon pour recueillir les lectures d’absorbance dans votre cahier de laboratoire.
Prenez trois lectures pour chaque échantillon pour trois répétitions techniques. Dans la première colonne, nous avons le numéro d’échantillon. Dans la deuxième colonne, nous avons des répliques biologiques où R1, R2, R3 représentent trois répétitions biologiques d’une lignée expérimentale.
Dans la troisième colonne, nous avons fait la moyenne des lectures d’absorbance obtenues à 280 nanomètres. Nous avons calculé la teneur en lignine dans la quatrième colonne à l’aide de la formule y=mx-c où x est la moyenne des valeurs OD.m et c sont tracées à partir de la droite de régression de la courbe standard préparée. La cinquième colonne est le poids après les lavages au méthanol et à l’eau.
C’est donc la façon dont on utilise pour l’estimation de la teneur en lignine en mg. Nous divisons donc la valeur obtenue dans la quatrième colonne par la cinquième colonne pour obtenir la valeur par mg de teneur en lignine dans la sixième colonne. Et cette valeur est multipliée par 1000 afin d’obtenir par gramme de poids de paroi cellulaire.
Et le pourcentage de teneur en lignine est calculé en divisant cette valeur par 1000 et en multipliant par 100. Enfin, nous obtenons la lignine moyenne en faisant la moyenne de la lignine de trois répétitions biologiques de chaque lignée expérimentale qui seront comparées à la moyenne d’une autre lignée expérimentale sous la forme d’un graphique à barres pour comprendre les différences dans la teneur en lignine. Nous pouvons également appliquer le test t des étudiants pour tester leur niveau de signification.
Dans la colonne A, nous avons la lignine de bambou commerciale, puis le poids de la lignine de bambou qui a été prise avant TGA et leurs lectures d’absorbance respectives à 280 nanomètres. Ces valeurs du tableau A ont été utilisées pour tracer un graphique dispersé dans la colonne B, qui nous donne la droite de régression avec les valeurs m et c. En C, nous avons comparé les valeurs obtenues en utilisant la courbe standard et la ligne expérimentale de lignine de bambou industrielle un et deux ont été comparées sous la forme d’un graphique à barres et le résultat est qu’elles montrent une différence entre elles.
