Ce flux de travail automatisé fournit une digestion enzymatique cohérente des protéines avec une excellente reproductibilité et débit. Cela améliore la précision et la fiabilité de la découverte, de la validation et de l’application clinique des biomarqueurs par spectrométrie de masse. L’avantage de cette technologie est que l’ensemble du flux de travail peut être complété pour 96 échantillons en environ cinq heures avec un CV intra-analyse et inter-analyse de moins de 20% pour la majorité des protéines.
Cette préparation précise d’échantillons à haut débit nous permet d’étudier les protéomes de la maladie des tissus ou des biofluides à plus grande échelle. En outre, le workflow automatisé de préparation d’échantillons protéomiques fournit une base solide pour une teneur élevée et une analyse protéomique quantitative. Le Dr Qin Fu, directeur du High Throughput Center de Cedar Sinai, et M. Casey Johnson, associé de recherche de mon laboratoire, démontreront la procédure.
Avant de commencer l’analyse, ajouter cinq microlitres de plasma humain sain mis en commun dans une plaque ronde de propylène de puits profond de 96 ronds. Lorsque tous les échantillons ont été chargés, ouvrez le logiciel du dispositif de manutention liquide et sous l’onglet méthode, sélectionnez à la maison tous les axes pour orienter le gestionnaire liquide automatisé. Confirmez que toutes les seringues du poste de travail ne contiennent pas de bulles d’air visibles et ouvrez une nouvelle méthode et cliquez sur Exécuter pour lancer la méthode.
Entrez vrai dans l’entrée une valeur à utiliser pour autosampler prompt à avoir une plaque d’autosampler préparé à la fin de la méthode et cliquez sur OK. Entrez-en un dans l’entrée d’une valeur à utiliser pour la première colonne invite et cliquez sur OK. Entrez 12 dans l’entrée d’une valeur à utiliser pour la dernière colonne invite et cliquez sur OK. Si une plaque d’échantillon est utilisée avec des volumes d’échantillon d’au moins 20 microlitres, entrez vrai dans l’entrée une valeur à utiliser pour l’invite de plaque d’échantillon et cliquez sur OK. Suivez les instructions dans la fenêtre d’installation guidée Labware et cliquez sur Continuer. Chargez les reagents appropriés dans les puits appropriés et cliquez sur Suivant. Cliquez à nouveau sur Suivant pour poser le jeu automatisé de gestionnaire liquide tel qu’illustré, y compris le reagent, la réaction, l’échantillon et les plaques d’autosampler, six puits 90 boîtes de pointe de microlitres, une boîte vide de pointe de 90 microlitres, et une boîte pleine de pointe de 230 microlitres.
Cliquez ensuite Sur Terminer pour commencer la méthode. À la suite de la centrifugation prompte, récupérer la plaque de réaction et placer la plaque dans la centrifugeuse. À la fin de la centrifugation, remettre la plaque de réaction à sa position dans le gestionnaire liquide automatisé et cliquez sur Continuer.
Pour la chromatographie liquide et l’analyse de spectrométrie de masse tandem, résoudre les peptides dans une colonne C18 de 2,1 par 100 millimètres de 3,5 micromètres par chromatographie liquide haute pression à débit élevé avec un débit de 250 microlitres par minute et analysé en ligne sur un spectromètre de masse triple quadrupole. Cinq minutes après le chargement, équilibrer la colonne avec une solution B tampon de 5 % et éliser les peptides avec un gradient linéaire de 5 à 35 % du tampon B pendant 30 minutes. À la fin de l’éution, laver la colonne avec 98 % de tampon B pendant 10 minutes, suivie d’un lavage de cinq minutes avec 5 % de tampon B avant de charger l’échantillon suivant.
Pour le détournement en ligne, utilisez une vanne de commutation en deux phases pour détourner l’élituent post-colonne vers les déchets avant qu’il n’entre dans la source iréo. Lorsque tous les échantillons ont été élucidés, des données de surveillance des réactions multiples peuvent être traitées. Dans cette analyse représentative, trois peptides de bêta-gal et deux peptides d’albumine ont été surveillés des protéines spiked de bêta-gal et d’albumine de plasma traitées.
La précision du workflow automatisé de préparation de l’échantillon a été calculée comme le pourcentage du coefficient de variance du flux de travail total de surveillance des réactions sélectionnées protéomiques moins le coefficient en pourcentage de variance de la spectrométrie de masse tandem chromatographie liquide. Comme prévu, de bonnes intensités de signal ont été observées pour l’albumine humaine de sérum et les protéines de bêta-gal. Pour surveiller la précision des étapes de transfert de liquide, des normes stables de peptide étiquetées isotopiques peuvent être piquées pour l’albumine endogène de sérum humain et la protéine exogène de bêta-gal dans les étapes indépendantes de transfert de reagent.
Pour valider le flux automatisé de préparation de l’échantillon protéomique, le coefficient intrajournal de la valeur de variance a été calculé à partir de 21 puits préparés le même jour. Le coefficient moyen de variance intrajournalière pour 40 protéines variait de 4 à 20 % Pour évaluer l’effet de bord du flux de travail automatisé à base de plaques, le coefficient de variance en pourcentage peut être calculé à partir de puits spécifiques dans des colonnes et des rangées désignées. Dans cette expérience représentative, les intensités multiples de signal de surveillance de réaction étaient semblables dans toutes les configurations de colonne et de ligne avec le coefficient de pourcentage de variance s’étendant de 3-22%Les étapes les plus importantes ajoutent un échantillon correctement selon la carte désirée de plaque de 96 puits et installent correctement la plaque de reagent selon l’instruction par le logiciel.
Cette méthode automatisée de préparation d’échantillons protéomiques permet aux chercheurs de recueillir des données protéomiques fiables et quantitatives à grande échelle.
