La préparation standard des échantillons rend difficile l’obtention d’un bon rapport signal-bruit lors d’expériences de diffraction des rayons X de microcristaux. Ce protocole vise à réduire les sources de cristaux formés de fond de manière contrôlée. L’utilisation de la robotique de congélation par poinçonnage et des grilles cryoTEM fournit une plate-forme robuste pour manipuler les microcristaux à plusieurs reprises, réduire le volume de liquide environnant et fournir une vitrification rapide de l’échantillon.
La dextérité nécessaire pour manipuler les grilles est similaire à celle nécessaire pour la récolte traditionnelle des cristaux. Un autre facteur important est la détermination des paramètres de buvard initial à l’aide de la solution de cristallisation, qui est essentielle pour réduire l’utilisation de l’échantillon. Pour commencer, installez et refroidissez le congélateur à piston automatique conformément aux instructions du fabricant.
Juste avant utilisation, déchargez les grilles cryoTEM pendant 25 secondes avec un courant de 15 milliampères et une pression de 0,39 millibar, puis conservez les grilles de décharge lumineuse dans une boîte de Petri couverte. Réglez l’humidité relative de la chambre d’échantillonnage sur 90 % et le temps de buvage sur cinq secondes. Assurez-vous que le congélateur est réglé pour plonger automatiquement l’échantillon une fois le buvard terminé.
Ouvrez le joint du puits de cristallisation et du réservoir. Ajoutez rapidement deux à cinq microlitres de la solution du réservoir dans la goutte de cristal pour maintenir le volume de la goutte. Transférer 10 microlitres de la solution du réservoir dans un tube de 0,5 millilitre pour une utilisation ultérieure et resceller le puits pour éviter que la goutte de cristallisation ne sèche.
Utilisez les pinces à congélation plongeantes pour choisir une seule grille de décharge de lueur et chargez la grille dans l’instrument avec le côté carbone tourné vers l’extérieur du bras de buvard. Faites pivoter les pinces qui maintiennent la grille de sorte que le côté carbone fasse face au bras de buvard. Utilisez une pipette de 2,5 microlitres pour appliquer deux microlitres de solution de réservoir sur le côté non support de la grille cryoTEM.
Faites pivoter la grille avec le côté carbone tourné vers l’extérieur du bras de buvard et appliquez soigneusement le liquide du réservoir sur le côté support du film de carbone de la grille. Lancez le processus de buvardage et observez le liquide tiré de la surface du carbone jusqu’à ce que l’onde de popping à travers la surface de la grille soit visible. Si l’onde de popping n’est pas visible, augmentez le temps de buvard d’une à deux secondes avant que le bras de buvard ne se rétracte de la grille.
Placez la plaque de cristallisation sous le microscope optique et positionnez bien la cible dans le champ de vision. Placez une grille de décharge incandescente fraîche dans le congélateur plongeant et appliquez le liquide du réservoir sur le côté non support de la grille, comme démontré précédemment. Faites pivoter la grille avec le côté support du film de carbone face à l’aisertage du congélateur plongeur.
Retirez le joint temporaire de la plaque de cristallisation et utilisez la pipette fixée à deux microlitres pour aspirer doucement la goutte de cristallisation à plusieurs reprises. Transférer deux microlitres de la boue de microcristaux aspirés dans le congélateur et appliquer tout l’échantillon du côté carbone de la grille cryoTEM. Initiez le buvard et observez la vague de popping, puis initiez immédiatement le gel de plongée.
Transférez rapidement la grille de l’éthane liquide à la boîte de grille immergée dans l’azote liquide. Après avoir bappé et gelé la grille, rétracter la grille plongée de l’éthane liquide en réinitialisant le congélateur. Retirez les pinces qui maintiennent la grille du congélateur et placez la grille sous le microscope optique.
Ajustez la mise au point fine et évaluez la densité des cristaux à travers la grille. Après avoir chargé la grille cryoTEM dans le SEM, alignez l’échantillon et allumez le faisceau d’électrons. Évaluez d’abord l’ensemble de la grille à un grossissement de 45X et enregistrez l’image, puis augmentez le grossissement pour une inspection plus approfondie des carrés de grille individuels jusqu’à ce que les cristaux individuels soient clairement observés.
Déplacez-vous autour de la grille et capturez les images fixes, en vous assurant que les grilles sont plates et que le film de support en carbone est en grande partie intact. Assurez-vous qu’il y a de nombreux monocrisaux avec un halo étroit de liquide vitrifié entourant le cristal et que les trous sont visibles dans le film de support en carbone. Tout en observant et en capturant les images de la grille, assurez-vous que les grandes régions de liquide vitrifié sont absentes, que la glace hexagonale ou la glace de surface ne sont pas dispersées sur la grille et que les cristaux ne se chevauchent pas et ne sont pas répartis uniformément sur le film de support.
Dans un grand dewar en mousse, refroidissez le nombre requis de porte-échantillons VMXm chargés dans la cartouche d’échantillon. Ajouter de l’azote liquide au-dessus de la position de l’échantillon dans le chargeur d’échantillons. Transférez rapidement la boîte de grille contenant des grilles chargées de microcristaux dans l’encastrement de la boîte de grille sur le chargeur d’échantillons et dévissez légèrement le couvercle pour garder le couvercle lâche et rotatif.
Soulevez la grille de la boîte de grille et faites pivoter la grille pour la déposer à plat sur le porte-échantillon. Placez rapidement l’outil circlip pré-refroidi sur la grille dans l’ouverture de la grille et appuyez sur le bouton pour installer le circlip. Ajouter l’azote liquide à environ 1,5 centimètre au-dessus du porte-échantillon.
Utilisez les pinces d’échantillon VMXm pour soulever soigneusement le porte-échantillon chargé et le replacer dans la cartouche d’échantillon. Remplacez le couvercle de la cartouche en vous assurant que la broche sur le dessus de la cartouche s’engage avec le trou dans le couvercle. Les micrographies électroniques à balayage de microcristaux préparés sur des grilles cryoTEM ont montré une dispersion minimale de fond.
La grille était exempte d’excès de liquide et un halo étroit de liquide a été observé autour des cristaux. Les cristaux polyédriques ont été observés individuellement ainsi que dans des amas. Des cristaux d’insuline légèrement plus gros ont également montré un certain agglutination avec des cristaux isolés.
De très grands microcristaux ont également été montés avec succès sur des grilles cryoTEM. Les trous dans le film de support en carbone étaient clairement visibles, indiquant un fort buvard. De nombreux échantillons nécessitaient une optimisation supplémentaire en raison de la variation du temps de transfert et de la concentration des microcristaux.
Les grilles surchargées de cristaux réduisent l’efficacité du buvard et plusieurs réseaux ont été enregistrés dans une seule image de diffraction. Un temps de buvardage court pour les solutions de cristallisation très visqueuses peut entraîner un échantillon trop humide. Pour une solution de cristallisation à viscosité plus faible, un temps de buvardage court entraîne le vol de microcristaux d’un côté des grilles.
Une préparation optimale des échantillons permet d’exploiter toutes les capacités de VMXm pour collecter des données de diffraction des rayons X de haute qualité à la résolution la plus élevée possible avec un rapport signal/bruit élevé. La détermination du buvard initial d’une solution de cristallisation est essentielle pour utiliser un échantillon minimal. Si l’échantillon est très limité, ignorez l’évaluation de la densité.
En fin de compte, il est préférable d’avoir un échantillon dilué. Ces échantillons sont maintenant prêts pour des expériences de diffraction des rayons X à la ligne de faisceau VMXm, la diffraction d’électrons microcristallins ou le fraisage par faisceau d’ions focalisé avant la micro-de-dent.
