Les auteurs remercient Lynne Foster pour son assistance technique dans les expériences d’infection, James Fitzpatrick du Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) pour l’accès au SEM, Scott Hultgren pour la souche UTI89kanR UPEC et David Hunstad pour la lecture critique du manuscrit.
Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (Graduate Research Fellowship to VPO#DGE - 1143954), par le Center for Women’s Infectious Disease Research de la Washington University School of Medicine (Pilot Research Award to NMG), par l’American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) et #14POST20020011 (NMG), et par les National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) et NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, projet II PI:ALL) et K01 DK110225-01A1 (NMG). Certaines des études sur les animaux ont été réalisées dans une installation soutenue par la subvention C06 RR015502 du NCRR. Le Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; où sem a été effectué) et MSJ ont été soutenus par la Washington University School of Medicine, le Children’s Discovery Institute de l’Université de Washington et le St. Louis Children’s Hospital (CDI-CORE-2015-505), la Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) et le National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts lié à cette étude.

La première étape critique de ce modèle consiste à identifier les souris qui n’ont pas éliminé la bactériurie UPEC au cours de la phase primaire d’infection urinaire. Ces souris doivent être retirées de l’expérience car elles confondraient autrement les taux de bactériurie UPEC après l’exposition à G. vaginalis. Après l’inoculation initiale de l’UPEC, l’urine doit être prélevée chaque semaine pour surveiller la clairance bactérienne. Environ 65 à 80 % des souris C57BL/6 élimineront une infection par UTI89kanR dans les 4 semaines. D’autres souches de souris consanguines ont des propensions différentes pour le dégagement UPEC42,43 et la formation de réservoirs et peuvent donc ne pas convenir à ce modèle. Le deuxième point critique est que des études empiriques ont déterminé que deux inoculations séquentielles de G. vaginalis (soit 12 h ou 1 semaine d’intervalle) sont nécessaires pour déclencher une émergence significative du réservoir au-dessus de l’émergence spontanée de fond qui se produit chez les souris témoins exposées uniquement au PBS. D’autres durées entre les deux expositions séquentielles n’ont pas été testées, mais pourraient donner des résultats similaires. Il est important de noter qu’une réduction des titres de vessie UPEC n’a été observée que dans le modèle dans lequel les expositions à G. vaginalis ont été données à 1 semained’intervalle 39. Bien que plus de deux expositions puissent être administrées, les preuves empiriques suggèrent que le cathétérisme répété à lui seul augmente l’émergence, ce qui peut confondre l’interprétation des résultats ou nécessiter un plus grand nombre d’animaux pour distinguer les différences entre les groupes d’exposition et les témoins. Enfin, la méthode de fixation de la vessie in situ comporte plusieurs étapes critiques. Une certaine habileté est nécessaire pour s’assurer que le fixateur reste à l’intérieur des vessies serrées. Les vessies dégonflées seront plus difficiles à imager par SEM. Il est également essentiel d’être très doux lors de l’inoculation du fixateur dans la vessie, car gratter l’urothélium avec le cathéter contenant un fixateur peut induire une exfoliation urothéliale indépendamment de ce qui est déclenché par G. vaginalis. Toutes les concentrations mentionnées dans le cocktail fixateur sont des concentrations finales. Des rapports inappropriés de ceux-ci peuvent entraîner une fixation insuffisante et un gonflement ou un rétrécissement des cellules. Les fixateurs doivent être réchauffés à des températures physiologiques pour éviter les chocs thermiques dans les cellules et les tissus. Le réchauffement apporte également une légère amélioration du taux de diffusion des fixateurs à travers les membranes plasmiques. Bien que la coloration à l’osmium puisse souvent être omise pour les échantillons préparés pour l’analyse SEM, il s’agit d’une étape essentielle de ce protocole pour stabiliser les lipides et prévenir la fissuration des membranes cellulaires lors du séchage aux points critiques.
Ce protocole peut être modifié pour tester d’autres souches UPEC et/ou G. vaginalis pour leur capacité à former des réservoirs et à déclencher leur émergence, respectivement. D’autres facteurs expérimentaux peuvent également être ajoutés, tels que l’exposition à d’autres bactéries vaginales (par exemple, Lactobacillus crispatus PVAS100) ou G. vaginalis tué par la chaleur, dont aucun ne démontre une pathologie dans ce modèle39. Lors de la sélection d’autres souches bactériennes à tester, il est important de démontrer une croissance constante de sorte qu’une concentration d’inoculum standard puisse être utilisée dans toutes les expériences. La croissance de JCP8151BSmR a été optimisée dans une chambre anaérobie. Cette souche pourrait probablement être cultivée dans un système GasPak anaérobie, mais cela nécessiterait une optimisation pour assurer une croissance bactérienne robuste. Enfin, il peut être possible de modifier le timing de certaines étapes du modèle. Par exemple, l’urine peut être recueillie à des moments plus précoces pendant la phase de formation du réservoir UPEC pour surveiller les réponses de l’UFC ou de l’hôte. Un effet indésirable de la collecte d’échantillons d’urine à des moments précoces (3, 6, 12 hpi) sur la progression de l’infection ou l’établissement de réservoirs n’a pas été observé dans ce modèle. L’émergence de réservoirs UPEC a été signalée après deux doses de JCP8151BSmR administrées 12 h ou 1 semaine, mais d’autres intervalles de temps n’ont pas encore été testés. Il peut également être possible de réduire la durée totale du modèle en réduisant la phase de formation du réservoir UPEC à 2 semaines (au lieu de 4 semaines), car de nombreuses souris éliminent la bactériurie à ce moment-là. Des études antérieures portant sur l’émergence de l’UPEC après l’exposition de la vessie à des exfoliants chimiques ont utilisé une phase de formation de réservoir UPEC de 1 ou 2 semainesen phase 17,18. Cependant, la diminution du temps nécessaire à l’élimination de la bactériurie UPEC peut se faire au prix d’exiger que davantage d’animaux soient éliminés de l’expérience. Enfin, l’analyse SEM de la vessie peut être effectuée à des moments supplémentaires pour observer la durée de l’effet de G. vaginalis sur l’urothélium.
En ce qui concerne le dépannage, il y a quelques considérations importantes spécifiquement en ce qui concerne l’analyse SEM de la vessie. Selon le fond de souris utilisé et la quantité d’inflammation présente, certaines vessies présenteront des parois très minces. Ces vessies ont tendance à s’enrouler davantage pendant le séchage des points critiques et peuvent donner une forme de coquille de cauris. Si cela se produit, la meilleure méthode consiste à couper la vessie en forme de coquille en deux le long de l’interface recourbée, puis une deuxième fois pour enlever la majeure partie du tissu en surplomb. La coupe fonctionne mieux avec une lame de rasoir à double tranchant revêtue de PTFE. L’excès de graisse peut parfois se solubiliser pendant les étapes de coloration à l’osmium. Cela peut entraîner des gouttelettes de graisse insolubles indésirables qui peuvent ne pas se laver pendant les étapes de rinçage et de déshydratation et qui peuvent se déposer à la surface de la vessie lors du séchage ultérieur. Ces gouttelettes peuvent apparaître sous la forme de petites sphères ou de structures en forme de disque dispersées sur l’échantillon (Figure 4D). Cela peut être atténué en s’assurant que le plus de tissu adipeux possible est retiré autour de la vessie. Le platine peut être substitué au revêtement à l’iridium, mais les épaisseurs doivent être réduites au minimum pour réduire le masquage des détails structurels fins. L’utilisation d’une étape rotative pendant le revêtement est fortement recommandée.
Une limitation de ce modèle est qu’il nécessite un grand nombre de souris. Seulement 65 à 80 % des souris C57BL/6 élimineront leur bactériurie UPEC et conviendront à l’inoculation ultérieure de G. vaginalis ou de PBS (voir la figure 2C). Pour obtenir 10 à 12 souris par groupe (inoculation de G. vaginalis vs PBS), environ 30 souris doivent être initialement infectées par l’UPEC. En outre, de multiples expériences sont probablement nécessaires pour obtenir les répliques biologiques nécessaires pour détecter la signification statistique. Lorsque les expositions ont été séparées de 1 semaine, l’émergence de l’UPEC s’est produite chez 14 % des souris exposées au PBS (figure 3B). Ainsi, la détection d’une augmentation significative de l’INFECTION URINAIRE À L’UPEC chez les souris exposées à G. vaginalis par rapport aux témoins PBS (puissance à 0,8; alpha = 0,05 [unilatérale]) nécessite de tester un total cumulatif d’au moins 40 souris pour chaque groupe d’exposition. Une considération supplémentaire est que ces expériences sont coûteuses et nécessitent beaucoup de main-d’œuvre. Les souris doivent être surveillées chaque semaine pour la clairance UPEC et le cours temporel expérimental est de 4-5 semaines selon que G. vaginalis est administré deux fois dans un délai de 12 heures ou deux fois à 1 semaine d’intervalle. Le SEM est exigeant en main-d’œuvre et peut être coûteux, en fonction de la disponibilité du microscope et des frais de service. La préparation de la vessie entière pour le SEM fournit un matériel abondant pour l’analyse, mais l’inconvénient est que l’analyse de chaque vessie peut prendre beaucoup de temps. Ainsi, il est probable que seul un nombre limité de vessies peut être analysé par SEM par rapport au nombre plus élevé d’animaux utilisés pour les titres d’urine et de tissu. En outre, l’obtention d’images de haute qualité des surfaces incurvées des « tasses » de la vessie nécessite des compétences en raison des ombres qui peuvent entraver la visibilité. Bien que le SEM de la vessie soit un outil utile pour visualiser l’exfoliation urothéliale, cette méthode est en grande partie qualitative. Étant donné que l’échantillon est fixé dans une forme ronde et qu’en raison de l’utilisation de glutaraldéhyde dans le fixateur, il n’est pas possible de dépister les bactéries exprimant par fluorescence par microscopie optique. Les colorants immunocolorants et chimiques sont incompatibles avec ce processus en raison de l’utilisation de glutaraldéhyde qui réticule la plupart des antigènes et de l’osmium et qui masquera les sites antigéniques et assombrira les tissus. Cela dit, la technique SEM est utile pour les paramètres qui peuvent être évalués quantitativement sans l’utilisation de sondes supplémentaires, telles que la taille des cellules48,49.
Ce modèle offre plusieurs avantages au-delà des méthodes décrites précédemment. Il permet d’examiner les mécanismes de l’UPEC rUTI causés par l’émergence des réservoirs de la vessie, par opposition à la réintroduction dans la vessie à partir d’une source extérieure. D’autres modèles d’infection urinaire r due à l’émergence de réservoirs de la vessie utilisent des agents chimiques (sulfate de protamine ou chitosane) pour provoquer une exfoliation urothéliale17,18, qui ne serait pas un déclencheur de l’infection urinaire chez les femmes. G. vaginalis est une bactérie urogénitale répandue qui a été détectée dans l’urine recueillie directement de la vessie par cathétérisme ou aspiration suprapubienne chez certaines femmes23,26. Ce fait, associé à l’association connue entre la VB (dans laquelle G. vaginalis envahit le vagin) et l’infection urinaire, suggère que G. vaginalis est un déclencheur cliniquement plausible de l’infection urinaire. Enfin, la méthode de fixation in situ de la vessie préserve l’ultrastructure de la vessie et limite les dommages, en veillant à ce que les couches de la vessie ne se séparent pas les unes des autres. Les méthodes précédentes de visualisation de l’urothélium demandaient traditionnellement à l’utilisateur de récolter, de couper en deux, d’étirer et d’épingler la vessie de manière aseptique sur un plateau de dissection avant d’immerger la vessie étirée dans le fixateur48. Cette méthode donne un échantillon très plat mais n’assure pas un étirement uniforme ou naturel du tissu et peut entraîner des zones trop et sous étirées (entraînant un tissu très ridé) et peut provoquer une séparation de la couche de la vessie. De plus, ces manipulations physiques de la vessie pour étirer et épingler le tissu peuvent causer des dommages, y compris l’exfoliation urothéliale. Une autre méthode consiste à immerger les vessies intactes dans un fixateur avant de les incorporer dans de la paraffine et d’acquérir des sections minces avec un microtome. Les sections minces sont inestimables pour les expériences d’immunohistochimie visant à examiner la localisation des bactéries et des protéines hôtes, mais une section mince ne permet pas de visualiser la surface urothéliale. Cette méthode SEM permet d’examiner la surface de toute la vessie en même temps.
Comme décrit, les applications futures de ce modèle comprennent l’essai d’autres souches UPEC pour déterminer si elles forment des réservoirs intracellulaires et le test d’autres souches de G. vaginalis pour évaluer si elles provoquent une exfoliation et l’émergence UPEC pour provoquer une infection urinaire. D’autres souches de souris au-delà des souris C57BL /6 peuvent également être testées, bien que les souris ayant une forte propension à développer une cystite chronique (comme les souris sur le fond C3H) ne soient pas recommandées, car trop de souris devraient être éliminées de l’expérience. Un avantage supplémentaire des souris C57BL/6 est que de nombreuses souches génétiques knockout sont disponibles dans le commerce. De telles souches offrent l’occasion d’interroger les facteurs hôtes impliqués dans la formation et/ou l’émergence des réservoirs.

Les infections des voies urinaires (IVU) imposent un fardeau important en matière de soins de santé dans le monde entier, affectant la qualité de vie de millions de personnes chaque année, en particulier les femmes1. Escherichia coli uropathogène (UPEC) est la cause la plus fréquente d’infection urinaire1. De nombreux patients (environ 20 à 30%) qui développent une infection urinaire connaîtront une infection urinaire récurrente (rUTI) dans les 6 mois malgré la clairance de l’infection initiale médiée par les antibiotiques2. Malheureusement, jusqu’à 5% des femmes préménopausées souffrent de 3 rUTI ou plus chaque année 3,4. Les épisodes séquentiels d’infection urinaire r peuvent être causés par la persistance de la même souche UPEC du cas index 5,6,7,8. Les données provenant d’échantillons humains et de modèles murins suggèrent que l’infection urinaire r de même souche pourrait être causée par l’UPEC résidant dans des réservoirs de repos dans la vessie. Chez l’homme, des CEPU ont été détectés dans des cellules épithéliales et des biopsies de la vessie de patients atteints d’infection urinaire 9,10,11,12,13. Des études chez des souris C57BL/6 ont démontré que certaines souches d’UPEC peuvent établir des réservoirs intracellulaires au repos dans la vessie, tels que détectés par microscopie à fluorescence et par homogénéisation et culture de tissu vésical, qui sont maintenus pendant des mois après la résolution de la bactériurie 14,15,16. Le traitement de la vessie avec des agents qui induisent l’exfoliation de l’épithélium de la vessie (urothélium), par exemple le sulfate de protamine17 ou le chitosane18, déclenche l’émergence de l’UPEC des réservoirs pour provoquer une infection urinaire. Ces données suggèrent que chez les femmes hébergeant des réservoirs UPEC de la vessie d’une infection antérieure, les expositions à la vessie qui conduisent à l’exfoliation urothéliale peuvent déclencher une rUTI.
Il existe de plus en plus de preuves que le microbiote vaginal contribue à l’infection des voies urinaires19,20. Gardnerella vaginalis est un membre fréquent du microbiote vaginal et urinaire 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Dans le vagin, la présence de niveaux élevés de G. vaginalis est associée à une dysbiose microbienne connue sous le nom de vaginose bactérienne (BV), qui affecte environ 30% des femmes 30,31,32. Les femmes atteintes de VB courent un risque plus élevé d’infection urinaire que les femmes ayant une communauté vaginale dominée par Lactobacillus 33,34,35,36,37. Chez les modèles murins, G. vaginalis provoque une exfoliation épithéliale à la fois dans le vagin38 et dans la vessie39. Chez les souris C57BL/6 hébergeant des réservoirs vésicaux UPEC, deux expositions vésicales séquentielles à G. vaginalis - mais pas au PBS - entraînent une réémergence de l’UPEC des réservoirs pour provoquer une infection urinaire urinaire à l’UPEC. L’émergence est mise en évidence par l’apparition de titres UPEC dans l’urine de souris qui avaient précédemment résolu la bactériurie UPEC et une diminution subséquente des titres d’homogénat de la vessie UPEC au sacrifice par rapport aux animaux témoins exposés au PBS39. Fait intéressant, il n’y a pas de colonisation durable par G. vaginalis dans la vessie. Dans la grande majorité des cas, deux expositions courtes, chacune avec moins de 12 (h) de G. vaginalis viable dans l’urine, sont suffisantes pour provoquer une exfoliation urothéliale et favoriser l’infection urinaire.
Ce protocole décrit un modèle murin d’infection urinaire r causée par l’UPEC résidant dans les réservoirs intracellulaires de la vessie, en utilisant l’inoculation de la vessie de G. vaginalis pour déclencher la récidive. L’avancée obtenue par ce modèle est que G. vaginalis est un déclencheur biologique cliniquement pertinent de l’infection urinaire par rapport aux agents chimiques précédemment utilisés. De plus, la survie relativement courte de G. vaginalis dans les voies urinaires de la souris permet d’examiner l’impact des expositions microbiennes transitoires sur l’urothélium, comme cela pourrait se produire après une activité sexuelle. En plus de décrire le modèle rUTI, ce protocole décrit également des méthodes de cytologie urinaire et de fixation in situ de la vessie et d’imagerie de l’urothélium par microscopie électronique à balayage (MEB).
Ce protocole d’infection urinaire UPEC récurrente induite par G. vaginalis utilise la souche UPEC UTI89 portant une cassette de résistance à la kanamycine (UTI89kanR)40. Toutes les souches d’UPEC testées n’ont pas été en mesure de former des communautés bactériennes intracellulaires au cours de la phase d’infection aiguë chez les souris41 et on ne sait pas encore si toutes les souches d’UPEC ont la capacité de former des réservoirs intracellulaires latents. La formation de réservoirs doit être confirmée avant l’utilisation d’autres souches d’UPEC dans le modèle. Ce protocole utilise un isolat spontané de G. vaginalis résistant à la streptomycine, JCP8151BSmR38. L’induction de rUTI par JCP8151BSmR nécessite deux inoculations séquentielles de G. vaginalis , administrées soit à 12 h, soit à 7 jours (j) d’intervalle39. Il reste à déterminer si d’autres souches de G. vaginalis induisent ou non une exfoliation et/ou une infection urinaire urinaire à l’UPEC. Il est essentiel d’utiliser des souches UPEC et G. vaginalis présentant une résistance connue aux antibiotiques (telles que la kanamycine ou la spectinomycine pour l’UPEC et la streptomycine pour G. vaginalis), car des antibiotiques peuvent être ajoutés aux plaques d’agar pour prévenir la croissance du microbiote endogène de souris qui pourrait autrement interférer avec le dénombrement des unités formant des colonies (UFC) pour surveiller l’infection. Ceci est particulièrement important pour la culture d’échantillons d’urine, car l’urine de souris contient souvent d’autres bactéries qui peuvent proliférer sur les plaques de culture sans antibiotiques. L’origine de ces bactéries endogènes dans l’urine de souris est inconnue, mais reflète probablement des bactéries périurétrales et urogénitales détectées lors de la collecte d’urine.
G. vaginalis est une bactérie anaérobie facultative et, par conséquent, ce protocole décrit la croissance de G. vaginalis JCP8151BSmR dans une chambre anaérobie. Si une chambre anaérobie n’est pas disponible, d’autres méthodes pour maintenir les conditions de croissance anaérobie (comme une poche GasPak dans un récipient hermétique) peuvent être utilisées. Alternativement, certaines souches de G. vaginalis (y compris JCP8151BSmR) se développeront dans un incubateur de culture tissulaire standard (5% de CO2). Tout comme l’utilisation de souches de G. vaginalis autres que JCP8151BSmR nécessite des tests pour s’assurer que les bactéries se comportent de manière similaire dans ce modèle, l’évolution des conditions de croissance nécessite la détermination empirique des durées idéales de culture (sur plaques et dans les liquides) et des équivalents de densité optique (OD) 600 pour atteindre les concentrations d’inoculum viables souhaitées. De plus, on ne sait pas si les conditions de croissance influencent la pathobiologie de G. vaginalis.
Enfin, lorsqu’ils envisagent d’utiliser ce modèle, les chercheurs doivent savoir qu’il peut nécessiter un plus grand nombre d’animaux par groupe que les modèles murins UTI typiques. C’est en partie parce que l’induction de l’infection urinaire nécessite que les souris résolvent la bactériurie UPEC causée par l’infection initiale de la vessie. Ainsi, toute souris qui ne parvient pas à éliminer la bactériurie (un phénotype généralement révélateur d’une infection rénale en cours) n’est pas incluse dans la phase rUTI du protocole. Le nombre de souris nécessaires pour alimenter ces études est également influencé par le taux d’émergence « spontanée » de l’UPEC dans l’urine (12-14% en moyenne). Enfin, différentes souches de souris ont des propensions différentes à développer une bactériurie chronique par rapport à la formation de réservoir intracellulaire42,43. Si vous utilisez des souches de souris autres que C57BL/6 dans ce modèle, il faut confirmer que les animaux développent des réservoirs intracellulaires UPEC quiescents.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30G x 1/2 needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 1/2&#34; straight forcep hemostat</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>487377</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE 600 Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminum SEM stub</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16111</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12340</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive carbon adhesive tab&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16034</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPD 300 Critical Point Drier</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofunnel metal clip</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964B</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15050</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16320</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hema 3 staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23123869</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro&#160;</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iridium</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91120</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isofluorane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mouse anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815024</td>
			<td>add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0445174</td>
			<td>UPEC growth plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0446173</td>
			<td>UPEC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin FE-SEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>scanning electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IQ-7000</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Vanox AHBT3 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19170</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427401</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone #3&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>DF-122-17-4</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated double edge razor blade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td>cutting bladders for SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A78300002</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon cytofunnel filter</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M965FWDV</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Double cytofunnel</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964-1D</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon double cytoslides (coated)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5991055</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12310</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer</td>
			<td>BioChrom</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>measuring bacterial OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11860038</td>
			<td>add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin slip tip syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0127-17-9</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice

Les infections urinaires récurrentes (rUTI) causées par Escherichia coli uropathogène (UPEC) sont courantes et coûteuses. Des articles précédents décrivant des modèles d’infection urinaire chez des souris mâles et femelles ont illustré les procédures d’inoculation bactérienne et de dénombrement dans l’urine et les tissus. Au cours d’une infection initiale de la vessie chez des souris C57BL/6, l’UPEC établit des réservoirs latents à l’intérieur des cellules épithéliales de la vessie qui persistent après la clairance de la bactériurie UPEC. Ce modèle s’appuie sur ces études pour examiner les infections urinaires causées par l’émergence de l’UPEC à partir de réservoirs de vessie latente. La bactérie urogénitale Gardnerella vaginalis est utilisée comme déclencheur de l’infection urinaire dans ce modèle, car elle est fréquemment présente dans les voies urogénitales des femmes, en particulier dans le contexte de la dysbiose vaginale associée à une infection urinaire. En outre, une méthode de fixation in situ de la vessie suivie d’une analyse par microscopie électronique à balayage (MEB) du tissu vésical est également décrite, avec une application potentielle à d’autres études impliquant la vessie.

Après l’inoculation, les titres UPEC sont détectables dans l’urine (Figure 2B). Le fait de ne pas plaquer les échantillons d’urine sur des milieux sélectifs contenant de la kanamycine entraînera probablement une prolifération de microbiote endogène de souris contaminant l’urine. Le niveau de bactériurie UPEC sera probablement élevé le jour 1 et pourrait augmenter au cours de la première semaine avant de diminuer à des moments ultérieurs (Figure 2C). Environ 65 à 80 % des souris n’auront pas d’ECI détectable dans l’urine de 28 dpi (Figure 2C, cercle vert). Ces souris peuvent être utilisées dans les étapes suivantes du modèle. Les souris qui restent bactériides (Figure 2C, ellipse rouge) doivent être éliminées de l’expérience.
Deux expositions séquentielles à G. vaginalis à 12 h (figure 3A) ou à 1 semaine d’intervalle (figure 3B) entraînent l’émergence d’UPEC à partir de réservoirs intracellulaires pour provoquer une bactériurie récurrente. Le niveau de bactériurie UPEC (test de Mann-Whitney) et la fraction de souris présentant upEC rUTI (test exact de Fisher) sont significativement plus élevés chez les souris exposées à G. vaginalis par rapport au groupe témoin PBS. L’analyse cytologique de l’urine détecte les PMN dans l’urine de souris exposées à G. vaginalis qui présentaient une émergence UPEC (Figure 3C). Dans le modèle avec deux expositions données à 1 semaine d’intervalle, les titres UPEC dans le tissu vésical sont plus faibles chez les souris exposées à G. vaginalis que chez les souris PBS (Figure 3D), probablement en raison de l’émergence d’UPEC dans les réservoirs et de la clairance ultérieure.
La visualisation du tissu vésical fixé in situ par SEM révèle de grandes cellules urothéliales parapluie superficielles tapissant la surface de la vessie chez des souris témoins exposées uniquement au PBS (Figure 4A). L’exfoliation urothéliale est mise en évidence par une perte de cellules parapluie superficielles, révélant des cellules épithéliales transitionnelles sous-jacentes plus petites chez des souris exposées à G. vaginalis (Figure 4B). Tôt après l’inoculation d’UPEC lors de l’établissement de réservoirs intracellulaires, les UPEC sont visibles sur l’urothélium et s’infiltrent dans les cellules exfoliantes (Figure 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> Graphique 2. Surveillance des titres UPEC dans l’urine pendant la phase 1 (formation du réservoir). (A) Schéma du placage des unités formant des colonies (UFC). (B) Image représentative des titres UPEC dans l’urine sur LB+kanamycine. Les cercles noirs indiquent les taches d’échantillon d’urine qui doivent être comptées pour calculer l’UFC / mL. (C) Évolution temporelle de la bactériurie UPEC chez les souris C57BL/6. Chaque ligne représente une souris individuelle, traçant les titres d’urine UPEC au fil du temps. La ligne pointillée indique la limite de détection (1000 UFC/mL). L’ellipse rouge indique quatre souris (sur 20) qui n’ont pas réussi à résoudre la bactériurie UPEC et ne seraient donc pas utilisées pour le modèle rUTI induit par G. vaginalis. Inversement, le cercle vert indique les souris qui ont résolu la bactériurie UPEC et sont passées aux phases suivantes. D) Tableau des données utilisées pour générer un graphique dans le panneau C. Jaune, UFC détectable; vert, pas d’UFC. (E) Randomisation des souris en groupes d’exposition en fonction du moment où l’UFC UPEC n’a plus été détectée dans l’urine (« Jour résolu »). Les numéros de souris dans la colonne de gauche du panneau D sont les mêmes que ceux indiqués dans le panneau E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> Graphique 3. G. vaginalis déclenche UPEC rUTI. Titres UPEC dans l’urine après deux expositions séquentielles des voies urinaires au PBS (cercles) ou à G. vaginalis (Gvag; carrés) à 12 h (A) ou 1 semaine (B) d’intervalle. Chaque symbole représente une souris individuelle. Les UPEC CFU/mL les plus élevés détectés chez chaque souris entre 1 et 3 j après la deuxième exposition sont tracés. Les souris sans bactériurie détectable sont tracées à la limite de détection (ligne pointillée). (C) Analyse cytologique urinaire montrant des cellules UPEC (pointes de flèches) et polymorphonucléaires (PMN) (flèches). Barre d’échelle = 20 μm. (D) Titres UPEC dans les tissus vésicaux prélevés 3 d à la suite de deux expositions séquentielles aux voies urinaires séparées de 1 semaine. Chaque symbole représente une souris différente et les zéros sont tracés à la limite de détection (ligne pointillée). Dans A, B et D, les boîtes sont au premier et au troisième quartile avec la médiane marquée et les moustaches de min à max. Tests de Mann-Whitney U * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> Graphique 4. Analyse SEM des vessies fixées in situ. Les vessies ont été prélevées sur des souris 3 h après deux expositions (à 12 h d’intervalle) au PBS (A) ou à G. vaginalis (C). Les lignes pointillées illustrent une seule cellule épithéliale urinaire, qui est plus petite dans les vessies exposées à G. vaginalis parce que les grandes cellules superficielles se sont exfoliées, révélant l’épithélium transitionnel sous-jacent. (B) Vessie collectée 6 h après l’inoculation initiale avec UPEC, au cours de la phase 1 du modèle, montrant une exfoliation urothéliale et une UPEC extracellulaire. (D) Exemple de gouttelettes de graisse insolubles présentes à la surface de la vessie. Les barres d’échelle sont de 20 μm dans les images principales et de 2 μm dans l’encart. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Un modèle murin d’inoculation transurétrale d’E. coli uropathogène (UPEC) pour établir des réservoirs de vessie intracellulaire latents et une exposition ultérieure de la vessie à G. vaginalis pour induire une infection urinaire UPEC récurrente est démontré. Le dénombrement des bactéries, la cytologie de l’urine et la fixation et le traitement in situ de la vessie pour la microscopie électronique à balayage sont également démontrés.

Infection récurrente des voies urinaires à Escherichia coli déclenchée par Gardnerella vaginalis Exposition à la vessie chez la souris

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

5.7K vues.  Washington University School of Medicine in Saint Louis. Un modèle murin d’inoculation transurétrale d’E. coli uropathogène (UPEC) pour établir des réservoirs de vessie intracellulaire latents et une exposition ultérieure de la vessie à G. vaginalis pour induire une infection urinaire UPEC récurrente est démontré. Le dénombrement des bactéries, la cytologie de l’urine et la fixation et le traitement in situ de la vessie pour la microscopie électronique à balayage sont également démontrés...

Vidéo: Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on Luria-Bertani (LB) agar at 37&deg;C in ambient air. UPEC strains grow as yellowish-white translucent colonies on LB agar. Following confirmation of appropriate colony morphology, single colonies are then picked to be cultured in broth. LB broth can be used for most uropathogenic bacterial strains. Two serial, overnight LB broth cultures can be employed to enhance expression of type I pili, a well-defined virulence factor for uropathogenic bacteria. Broth cultures are diluted to the desired concentration in phosphate buffered saline (PBS). Eight to 12 week old female mice are placed under isoflurane anesthesia and transurethrally inoculated with bacteria using polyethylene tubing-covered 30 gauge syringes. Typical inocula, which must be empirically determined for each bacterial/mouse strain combination, are 106 to 108 cfu per mouse in 10 to 50 microliters of PBS. After the desired infection period (one day to several weeks), urine samples and the bladder and both kidneys are harvested. Each organ is minced, placed in PBS, and homogenized in a Blue Bullet homogenizer. Urine and tissue homogenates are serially diluted in PBS and cultured on appropriate agar. The following day, colony forming units are counted.

This video will demonstrate methods to transurethrally induce mouse urinary tract infections and quantify the extent of resulting infections.

Induction transurétrale d&#39;infection des voies urinaires souris

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Recherche

Immunologie et infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Après Cell-sort<em&gt; E. coli</em&gt; Après infection par le phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Kératite herpétique récurrente stromale chez la souris, un modèle pour l&#39;étude de l&#39;homme HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Modèle non-invasive de neuropathogènes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Maladies infectieuses chez le rat nouveau-né

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

Une étape négative de purification chromatographique<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Activation des neutrophiles protéine surexprimée dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En mode batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

Infection des voies urinaires chez un modèle Animal petit : cathétérisme transuréthrale de souris mâles et femelles

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Détection de la colonisation de Escherichia Coli entéro-hémorragique en hôte murin par système de Bioluminescence Non invasif In Vivo

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

La surexpression et la purification de l&#39;être humain<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransférase dans<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Un protocole Facile à générer des protéines relativement acétylées chez Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.