Les auteurs tiennent à remercier Shelly Xie et Jennifer Payne pour leur assistance technique d&#39;experts. Ce travail a été rendu possible grâce à des subventions de la Société d&#39;urologie pédiatrique et le Fonds de recherche de Stanford en pédiatrie.

I. Préparation de sonde urétrale <ol><li> Pour chaque vessie et du rein de souris à échantillonner, placez 5-6 billes en acier inoxydable (vessie, 1,6 mm ou de 0,9 à 2,0 la taille mélange mm) ou des billes d&#39;oxyde de zirconium (rein, 0,5 mm taille) dans un tube cryovial, respectivement. Autoclaver les tubes de perles contenant. </li><li> Après les tubes refroidir à température ambiante, ajouter 200 microlitres de PBS stérile à chaque acier billes contenant le tube inox et 400 microlitres de PBS stérile à chaque oxyde de perles tube contenant du zirconium. </li><li> Nous préparons sonde urétrale décrite par Hung et Hultgren 13. Autoclave une paire propre de tête plate pinces et de ciseaux fins (iris ou de type similaire) et permettre les instruments à refroidir à température ambiante. Essuyez les surfaces d&#39;une hotte à flux laminaire avec de l&#39;éthanol à 70%. Dans la hotte, couper un 30 cm (approximative) du segment de tuyau en polyéthylène. Aseptiquement place une aiguille de calibre 30 stériles (1 / 2 pouces longue aiguille) sur une seringue stérile de 3 cc. Ramassez une extrémité du tuyau de polyéthylène coupés avec des pinces à l&#39;autoclave et faites glisser le tube sur l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce qu&#39;il rencontre le moyeu. Couper le tube de telle sorte que d&#39;environ 2 cm s&#39;étend au-delà de la pointe de l&#39;aiguille. Retirer le cathéter de la seringue et le placer dans une boîte de Pétri stérile. </li><li> Pour réduire la probabilité de contamination croisée, nous faisons un cathéter pour chaque souris. Après tous les cathéters sont faites, les stériliser par une exposition dans un plat de Pétri découverts à une irradiation UV pendant au moins 30 minutes. Ne pas regarder directement les lampes UV ou exposer toute partie du corps dans la hotte tandis que les lampes sont activées. Après exposition aux UV, les cathéters peuvent être stockées à long terme dans la boîte de Pétri. Nous vous recommandons de sceller le plat avec du parafilm pour aider à maintenir la stérilité. </li></ol> II. Inoculation à l&#39;animal <ol><li> Souris doivent arriver au moins une semaine avant la manipulation expérimentale, afin d&#39;éviter le stress induit par des facteurs confondants. Des souris femelles sont utilisées car l&#39;urètre souris mâle est extrêmement difficile à cathétériser. CBA / J est une couramment utilisées, l&#39;UTI sensibles souche de souris consanguines. Souris devrait être utilisé entre 8 et 12 semaines d&#39;âge, puisque c&#39;est la fenêtre de la maturité immunologique avant la sénescence. Le premier jour de l&#39;expérience, tremper le bout d&#39;une anse stérile inoculation dans un flacon de stock bactériennes congelées. Racler un petit inoculum et hors série sur une plaque de gélose appropriée. Généralement uropathogènes, E. coli (UPEC) et d&#39;autres souches peuvent être cultivées pendant une nuit sur ​​le milieu de Luria-Bertani (LB) d&#39;agar à 37 ° C dans l&#39;air ambiant. UPEC souches poussent aussi solide, blanc-jaunâtre colonies translucides sur gélose LB. Remettre immédiatement le stock bactérienne au congélateur. Souches uropathogènes bactérienne peut devenir moins virulent dans le temps avec répétées, les cultures de série. Par conséquent, nous recommandons de stries sur une gélose fraîche pour chaque expérience. </li><li> Le jour 2 de l&#39;expérience, après avoir confirmé la morphologie des colonies bon, ramasser des colonies isolées à partir de plaques d&#39;agar et le lieu dans au moins 5 cc de bouillon de culture pendant la nuit. Bouillon LB peut être utilisé pour la plupart des souches bactériennes uropathogènes (37 ° C, 200 rpm dans l&#39;air ambiant). Gardez les bouchons en vrac sur les tubes de bouillon de culture pour permettre l&#39;aération. </li><li> Au jour 3 de l&#39;expérience, de prendre 10% du bouillon de culture première et culture dans un bouillon à nouveau pendant la nuit (généralement 37 ° C et 200 rpm), pour améliorer l&#39;expression de type I pili. Cultures de bouillon de série permet d&#39;optimiser uropathogenicity bactérienne, car les pili de type I a été démontré pour être un facteur de virulence essentiel pour uropathogènes in vivo 1. Gardez les bouchons en vrac sur les tubes de bouillon de culture pour permettre l&#39;aération. </li><li> Au jour 4, de l&#39;expérience, mesurer la DO 600 de la culture en bouillon du jour 3. S&#39;il n&#39;est pas déjà connu pour la souche bactérienne testée, effectuez dix fois plaquage de dilution en série sur au moins 7 logs (dilutions effectuées avec du PBS, les cultures effectuées sur gélose LB, 37 ° C une nuit d&#39;incubation) pour déterminer la relation entre la DO 600 et CFU / ml. En règle générale, une DO 600 de 0,4-0,5 correspond généralement à la 1-2x10 7 cfu par 50 microlitres. Une fois la relation entre l&#39;OD 600 et UFC / ml a été déterminée, on peut ajuster le bouillon de culture à la DO 600 correspondant à l&#39;ufc désiré par souris dans 50 microlitres de PBS. Certains travaux ont suggéré que l&#39;inoculation de 10 microlitres, plutôt que 50, conduit à moins de reflux dans l&#39;kidneys6. Cependant, la plupart des publications ont rapporté l&#39;utilisation de 50 microlitres par souris. Généralement, les gammes ufc souhaitée entre 10 6 et 108 ufc / souris, mais chaque combinaison souche bactérienne / souris doit être empiriquement testée in vivo. </li><li> Pour aider à s&#39;assurer que les inoculums ne sont pas annulés immédiatement après l&#39;instillation, les souris doivent être privés d&#39;eau pendant au moins 30 minutes avant l&#39;induction de l&#39;anesthésie générale. Une autre manoeuvre clé est d&#39;induire la miction avant l&#39;induction de l&#39;anesthésie par gommante souris et en appuyant doucement la partie inférieure Abdomfr. Deux à 2,5% d&#39;isoflurane est une dose d&#39;induction sûre pour les 8-12 semaines vieilles souris CBA féminine, suivie par l&#39;anesthésie de maintenance avec 1,8 à 2% d&#39;isoflurane. </li><li> Une fois l&#39;anesthésie est réalisée, les souris sont placées en position couchée avec leur tête inséré dans une coiffe connecté à l&#39;isoflurane contenant de l&#39;oxygène. Le bas-ventre est massé pour évacuer l&#39;urine de la vessie. Si la vessie est relativement vide, cette manoeuvre peut ne pas donner l&#39;urine. Le bas de l&#39;abdomen et du périnée est imbibé d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Une seringue de 1 cc stérile sans aiguille est utilisée pour établir l&#39;inoculum désiré bactérienne. Ensuite, un cathéter stérile urétrale est aseptiquement placés sur la seringue. L&#39;excès de tube est coupé le cathéter avec une paire de ciseaux de telle sorte que seulement 1-2 millimètres de tubes restent en aval de la pointe de l&#39;aiguille. Ensuite, la seringue est taraudé et le piston enfoncé avec la seringue verticale pour enlever toutes les bulles. Une cuillerée de gelée de lubrification bactériostatique est aspergé sur une boîte de Pétri stérile ou à l&#39;intérieur de l&#39;enveloppe seringue stérile. L&#39;extrémité du cathéter (avec une seringue jointe) est plongé dans la gelée. Si plusieurs souches bactériennes sont actuellement testés dans la même expérience, faites attention à ne pas utiliser la même goutte de gelée pour lubrifier les cathéters contenant des souches différentes. </li><li> En utilisant un microscope stéréo (0,8 x au zoom 5x) pour l&#39;agrandissement, le capuchon du clitoris de la souris anesthésiée est doucement saisi dans la main non dominante avec une paire de pinces à dents fines et soulevé céphalique pour exposer le rose profond méat urétral ( Figure 1). La seringue (avec cathéter attaché) est saisi dans la main dominante avec un grip crayon et l&#39;extrémité du cathéter est engagé dans le méat urétral à un angle de 45 degrés. Le capuchon du clitoris est tendu dans l&#39;axe de la seringue, de manière efficace &quot;chargement&quot; de l&#39;urètre sur le cathéter. Cette manœuvre est essentielle puisque l&#39;urètre de la souris est redondante. Le cathéter doit glisser facilement dans la vessie (jusqu&#39;à la plate-forme, la figure 2), et peut être doucement tournoyé pour aider à naviguer dans les plis redondants de l&#39;urètre. Une fois le cathéter S&#39;articulant, la seringue peut être abaissé jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit parallèle à l&#39;axe longitudinal de la souris. La main non dominante peut descendre la pince pour aider à stabiliser la position du cathéter et la seringue que la main dominante est utilisée pour injecter lentement l&#39;inoculum (au moins 5 secondes). Si le fluide est considéré coule autour du cathéter pendant l&#39;injection, soit la vessie est pleine ou le cathéter est dans le vagin (juste caudale de l&#39;urètre). L&#39;injection doit être immédiatement arrêté et la position du cathéter soigneusement examinée. Si le cathéter a été dans l&#39;urètre, la souris étant donné devraient pas être inclus dans l&#39;expérience. D&#39;autre part, un cathéter égaré dans le vagin peuvent être repositionnées et l&#39;injection ré-essayé. Après l&#39;injection, le cathéter et la seringue est lentement retiré de la souris. </li><li> Pour réduire la probabilité du début de la miction post-inoculation, ce qui peut évacuer les bactéries administrés et ainsi conduire à des niveaux d&#39;infection variable, certains chercheurs maintiennent souris sous anesthésie pendant 30 minutes après inoculation10 transurétrale. Après la chirurgie, les souris doivent récupérer sur une couverture chauffante nettoyer avec une observation continue pour confirmer le retour des modèles de respiration et d&#39;activité normale. Une fois que les animaux ont complètement récupéré la capacité de ramper, ils peuvent être retournés à la literie contenant des cages. </li></ol> III. UFC mesure dans les tissus infectés <ol><li> Diverses publications de souris UTI ont rapporté les résultats de culture de 6 heures à une semaine ou plus après l&#39;inoculation. Les points de temps optimal doivent être déterminées empiriquement pour chaque combinaison de souche / souris bactérienne. Urine émise est obtenue pour la culture en gommante souris sur une boîte de Pétri stérile. Urines collectées doivent être conservés sur la glace en tout temps. De multiples tentatives pour obtenir l&#39;urine annulés pendant plusieurs heures peut être nécessaire, puisque la souris est mictions fréquentes, de faible volume (30-100 microlitres par void), et le stress-dépendante. </li><li> Après l&#39;obtention d&#39;échantillons d&#39;urine annulée, nous sacrifions les souris par dislocation cervicale et de l&#39;isoflurane. L&#39;abdomen est ouvert de façon aseptique. Si un échantillon d&#39;urine a été annulée pas réussi à obtenir plus tôt, une petite quantité d&#39;urine peut souvent être aspiré à travers la paroi de la vessie à l&#39;aide d&#39;une aiguille de calibre 30 et une seringue. </li><li> Un ou deux reins sont retirés, émincées dans au moins 4 pièces (chaque pièce doit être inférieure à 50 microgrammes) sur une boîte de Pétri stérile, et placés dans le zirconium billes / PBS contenant cryotubes sur la glace. La vessie est enlevée, hachée en au moins quatre morceaux, et placés dans des billes d&#39;acier inoxydable / PBS contenant cryotubes sur la glace. Le tissu / perle / PBS contenant cryotubes sont placés dans un homogénéisateur Bullet Blender et les tissus sont homogénéisés à l&#39;aide du &quot;8&quot; réglage de la vitesse pendant une minute. Il est fréquent que certains fragments de tissus de rester après homogénéisation. Aussi longtemps que 50-100 microlitres d&#39;homogénat liquide peut être pipeté, fragments solidesne sont pas nécessairement un problème. Si le temps d&#39;homogénéisation est augmenté pour certains échantillons, il est essentiel de le faire pour tous les tissus afin de maintenir la cohérence de l&#39;homogénéisation. Nous utilisons un Bullet Blender homogénéisateur car il évite la possibilité de contamination croisée, est plus rapide que le traitement des échantillons individuels, un par un en utilisant un homogénéisateur standard, et ne modifie pas significativement la chaleur les échantillons étant homogénéisé. </li><li> Au moins deux ou trois à dix dilutions d&#39;urine recueillis et homogénats de tissus devrait être réalisé dans une plaque de microtitration. Pour les expériences préliminaires, il peut être prudent de faire au moins sept à dix dilutions. Culture jusqu&#39;à 100 microlitres d&#39;urine, la vessie et / ou des homogénats de rein sur gélose appropriée. Depuis les échantillons d&#39;urine peuvent être à volume limité, il peut être nécessaire d&#39;apporter leurs volumes à 100 microlitres avant d&#39;effectuer dix dilutions. Si cela est nécessaire, la dilution initiale (avant dix-dilution) devront être pris en compte dans les calculs définitifs des rendements bactérienne. Nous préférons UPEC culture sur l&#39;éosine-bleu de méthylène ou gélose de MacConkey (une nuit d&#39;incubation à 37 ° C), car ces médias sont sélectifs pour les germes à Gram négatif. UPEC souches poussent sur gélose de MacConkey que centralement ombiliquées, rouge-rose colonies en raison de leur capacité à fermenter le lactose. </li><li> Après une nuit de culture, compter le ufc pour chaque plaque. Pour les échantillons dilués en série, la dilution plaque contenant 50-100 colonies est considéré comme le résultat le plus précis. &quot;Retour&quot; calculer ufc par les tissus, par milligramme de tissu, ou par ml. </li></ol> IV. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Méat urétral (sombre tissu rose) exposées par la levée capuchon du clitoris céphalique avec une pince (au-delà haut de la photo) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Cathétérisés urètre. Le clitoris bifide peut être vu juste au-dessus du cathéter. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Vessie Figure 3. Ufc compte 2 jours après l&#39;infection transurétrale de 8 semaines vieilles femelles souris CBA / J avec uropathogènes E. coli. Vessies ont été homogénéisés et ufc / ml déterminée par dilution et étalement sur gélose MacConkey série. Diamants indiquent ufc / ml pour chaque souris, la barre horizontale indique médiane ufc / ml.

<ol>
	<li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice.">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li><li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract.">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li><li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. 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L&#39;induction d&#39;infection des voies urinaires de la souris par inoculation transurétrale de bactéries est une procédure établie de longue date, mais techniquement exigeante 11. Hung et Hultgren récemment publié une excellente analyse des techniques d&#39;infection des voies transurétrale de souris urinaires 13. Dans ce papier, nous tentons d&#39;illustrer davantage les subtilités de cette approche expérimentale. Les novices peuvent pratiquer leur techniqu...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>640201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caps for cryovial tubes, with 'O' ring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>440011-N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bullet Blender</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Next Advance</td>
<td>BBX24</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zirconium Oxide Beads (0.5mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>ZROB05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Beads (1.6mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB14B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CBA/J Mice, 8-12 week old female</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratories</td>
<td>000656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>1.10285.0500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>NDC 10019-773-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculating loops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-363-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eosin-methylene blue (EMB) agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Himedia Laboratories</td>
<td>MM022-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MacConkey agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212123</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>427401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 gauge needles, 1/2 inch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>305106</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml tuberculin Slip-Tip syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3 ml Luer-Lock syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309585</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transurethral induction of mouse urinary tract infection

Souches uropathogènes bactériennes d&#39;intérêt sont cultivés sur gélose. Généralement, uropathogènes<em&gt; E. coli</em&gt; (UPEC) et d&#39;autres souches peuvent être cultivées pendant une nuit sur le milieu de Luria-Bertani (LB) d&#39;agar à 37 ° C dans l&#39;air ambiant. Souches UPEC grandir comme blanc-jaunâtre colonies translucides sur gélose LB. Après confirmation de la morphologie des colonies échéant, des colonies isolées sont ensuite repris pour être cultivées dans le bouillon. Bouillon LB peut être utilisé pour la plupart des souches bactériennes uropathogènes. Deux ports série, la nuit cultures de bouillon LB peut être employé pour amplifier l&#39;expression de type I pili, un facteur de virulence bien définis pour les bactéries uropathogènes. Les cultures en bouillon sont diluées à la concentration voulue en tampon phosphate salin (PBS). Huit à 12 semaines vieilles souris femelles sont placées sous anesthésie à l&#39;isoflurane et transurethrally inoculés avec des bactéries à l&#39;aide de polyéthylène recouvert de tubes de 30 seringues de calibre. Inoculums typiques, qui doit être déterminé empiriquement pour chaque combinaison de souche / souris bactérienne, sont de 10<sup&gt; 6</sup&gt; À 10<sup&gt; 8</sup&gt; UFC par souris dans 10 à 50 microlitres de PBS. Après la période d&#39;infection désiré (une journée à plusieurs semaines), les échantillons d&#39;urine et de la vessie et les deux reins sont récoltés. Chaque organe est hachée, placé dans du PBS, et homogénéisé dans un homogénéisateur Bullet Bleu. Homogénats d&#39;urine et les tissus sont dilués en série dans du PBS et cultivées sur gélose appropriée. Le jour suivant, les unités formant colonies sont comptées.

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Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Cette vidéo va montrer des méthodes pour induire des infections de souris transurethrally des voies urinaires et de quantifier l&#39;ampleur des infections résultant.

Induction transurétrale d&#39;infection des voies urinaires souris

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.4K vues.  Stanford University. Cette vidéo va montrer des méthodes pour induire des infections de souris transurethrally des voies urinaires et de quantifier l'ampleur des infections résultant.

Vidéo: Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Préparation de la souris Immunogène hypophysaires pour l&#39;induction de hypophysite auto-immune expérimentale

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

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Immunologie et infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

L&#39;induction de hypophysite auto-immune expérimentale chez la souris SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolement des ARN Pseudomonas aeruginosa La colonisation du tractus gastro-intestinal murin

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolement des lymphocytes de souris muqueuses génitales Tract

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

Infection des voies urinaires chez un modèle Animal petit : cathétérisme transuréthrale de souris mâles et femelles

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into the urinary bladder to either induce animal models of bladder pathologies or evaluate the effectiveness of intravesical treatments. Most rodent models of lower urinary tract (LUT) pathologies are induced in female mice due to ease of intravesical instillation of the substances via the female urethra. However, due to anatomical differences between the female and male LUT, transurethral instillation in a male mouse has been deemed a very challenging procedure, and it has not been previously described. In this manuscript, we provide a detailed description of how to prepare polyethylene (PE) tubing for subsequent insertion into the urethra of a male mouse. In addition, we discuss the ideal types of PE tubing to be used depending on the desired site of inoculation. Furthermore, we describe point by point how to prepare an animal for a successful transurethral instillation to avoid injury to the urethra and ensure the delivery of the solution to the desired location. The procedure is started by retracting the prepuce and the glans to expose the opening of the urethral meatus. Next, the glans are grasped by blunt non-crushing forceps to stabilize the penis and the PE tubing. The PE tubing is first inserted into the urethral meatus parallel to the animal body, then its angle is adjusted by tilting the catheter to maneuver it to follow the natural curvature of the urethra. This technique can be used to induced murine models of bladder pathologies and/or evaluate the effectiveness of intravesical treatments in male mice.

Transurethral instillation is a challenging procedure and has not been well described in the literature. The aim of this manuscript is to describe a technique for transurethral insertion of a catheter for intravesical delivery of liquids with active substances into the urinary bladder and/or prostate in adult male mice.

Transuréthrale médicamenteuse chez les souris mâles adultes

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Modèles de souris de l’Infection à Helicobacter et Pathologies gastriques

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

Isolement des simples communautés bactériennes intracellulaires généré à partir d’un modèle murin d’Infection des voies urinaires pour l’analyse de cellules individuelles en aval

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Induction de blessure pulmonaire de souris par injection endotrachéale de bleomycine

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 million IBD patients. It is generally accepted that a dysregulated immune response to gut bacteria initiates the disease and disrupts the mucosal epithelial barrier. We recently show that gut-homing regulatory T (Treg) cells are a promising therapy for IBD. Accordingly, this article presents a protocol for in vivo augmentation of gut-homing Treg cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to produce locally high concentrations of two molecules de novo, active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and active vitamin A (retinoic acid or RA). We chose 1,25(OH)2D and RA based on previous findings showing that 1,25(OH)2D can induce the expression of regulatory molecules (e.g., forkhead box P3 and interleukin-10) and that RA can stimulate the expression of gut-homing receptors in T cells. To generate such engineered dendritic cells, we use a lentiviral vector to transduce dendritic cells to overexpress two genes. One gene is the cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1 that encodes 25-hydroxyvitamin D 1&#945;-hydroxylase, which physiologically catalyzes the synthesis of 1,25(OH)2D. The other gene is the aldehyde dehydrogenase 1 family member A2 that encodes retinaldehyde dehydrogenase 2, which physiologically catalyzes the synthesis of RA. This protocol can be used for future investigation of gut-homing Treg cells in vivo.

Here we present a protocol for in vivo augmentation of gut-homing regulatory T cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to locally produce high concentrations of the active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and the active vitamin A (retinoic acid or RA) de novo.

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...