Ce protocole est conçu pour déterminer la localisation subjectochondrial des protéines mitochondriales de levure, qui est considérée comme une étape fondamentale lors de l’élucidation de la fonction protéique mitochondriale. Le protocole convient à nos souches de levure maintenues dans différentes conditions de croissance. Représentant un outil puissant pour la recherche comme l’étude des mitochondries.
Pour commencer, des cellules striées de glycérol stockées à 80 ° C sur une plaque de gélose YPD pour isoler des colonies uniques de la souche d’intérêt. Et incuber la plaque à 30 °C pendant 2 à 3 jours. Préparer une culture de départ en inoculant 2 à 3 colonies individuelles de la plaque de gélose YPD dans une fiole d’Erlenmeyer de 100 ml contenant 10 à 30 ml de milieu YPGal.
Incuber la fiole à 30 °C pendant 24 heures avec une agitation vigoureuse à 180 à 200 tr/min. Diluer la culture de démarrage dans 1 L de milieu YPGal frais à une densité optique inférieure à 0,1 à 600 nm. Cultivez les cellules à 30 ° C avec une agitation vigoureuse à 180 à 200 tr / min pendant environ 12 heures, jusqu’à ce que la densité optique atteigne 1 à 1,5.
Effectuer l’isolement des mitochondries hautement purifiées comme décrit dans le texte. Et déterminez la concentration en protéines de la préparation mitochondriale hautement purifiée, en utilisant le test de Bradford, en suivant les instructions du fabricant. Ajuster la concentration en protéines à 10 mg/ml avec un tampon SEM glacé.
Transférer 40 l de mitochondries hautement purifiées dans quatre tubes de microcentrifugation prérefroidis et marqués de 1,5 ml. Ajouter 360 l de tampon SEM dans les premier et deuxième tubes. Et 360 l de tampon EM dans les troisième et quatrième tubes.
En utilisant le schéma de pipetage, selon le texte, ajouter 4 L de protéinase K fraîchement préparée dans le deuxième et le quatrième tube. Après avoir mélangé doucement tous les tubes, incuber sur de la glace pendant 30 minutes avec un mélange occasionnel. Pour arrêter l’activité de la protéinase K, ajoutez 4 L de PMSF de 200 mM aux quatre tubes.
Centrifuger les tubes à 20 000 x g pendant 30 minutes à 4 C.Et recueillir le surnageant, sans déranger la pastille, dans un nouveau tube de microcentrifugation pré-réfrigéré étiqueté de 1,5 ml. Ensuite, remettez en suspension la pastille dans 400 l de tampon SEM glacé. Pour inactiver les traces possibles de protéinase K, précipiter le surnageant collecté et remettre la pastille avec de l’acide trichloroacétique à une concentration finale de 10% Incuber les tubes sur de la glace pendant 10 minutes.
Centrifuger les échantillons traités à l’acide trichloroacétique pendant 10 minutes à 12 000 x g à 4 C.Et après avoir retiré le surnageant, remettre la pastille dans 200 l de tampon d’échantillon. Si le bleu de bromophénol jaunit, ajouter 1 à 5 l de base tris de 1 M, jusqu’à ce qu’il devienne bleu. Ajouter 4 l de PMSF de 200 mM à tous les tubes.
Conservez les échantillons à 80 °C jusqu’à ce qu’ils fassent l’objet d’une analyse plus approfondie par SDS-PAGE et western blot. Transférer 200 l de mitochondries hautement purifiées dans un tube de microcentrifugation pré-réfrigéré de 1,5 ml. Diluez les mitochondries d’un seul fois avec un tampon SEM glacé.
À l’aide d’un sonicateur compatible avec de petits volumes, soniquer les mitochondries 3 fois pendant 30 secondes sur de la glace. Centrifuger l’échantillon pendant 30 minutes à 100 000 x g à 4 C.Et prélever le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation prérefroidi de 1,5 ml. Après avoir marqué le tube comme S"pour la fraction protéique soluble, gardez le tube sur la glace.
Remettez en suspension la pastille de l’étape précédente dans 400 l de tampon SEM glacé. Transférer 100 l de la pastille remise en suspension dans un nouveau tube de microcentrifugation prérefroidi de 1,5 ml. Étiqueter le tube comme SMP"pour la fraction de particules de submitochondrial et garder le tube sur la glace.
Diluer les 300 l restants de granulés remis en suspension d’un seul fois avec du carbonate de sodium de 200 mM fraîchement préparé. Et incuber l’échantillon dilué sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez l’échantillon pendant 30 minutes à 100 000 x g à 4 C.Prélèvez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation pré-réfrigéré de 1,5 ml.
Étiqueter l’échantillon comme CS"pour la fraction de surnageant de carbonate et garder le tube sur la glace. Remettez en suspension la pastille de l’étape précédente dans 400 l de tampon SEM glacé. Et nommez l’échantillon CP"pour la fraction précipitée de carbonate.
Précipiter tous les échantillons avec de l’acide trichloroacétique à une concentration finale de 10% et incuber les tubes sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez les échantillons pendant 10 minutes à 12 000 x g à 4 C.Après avoir retiré le surnageant, remettez chaque pastille dans le tampon de l’échantillon. Si le tampon de l’échantillon devient jaune, ajouter 1 à 5 l de base Tris de 1 M jusqu’à ce qu’il devienne bleu.
Ajouter 1 l de PMSF de 200 mM à tous les tubes et conserver à 80 C jusqu’à une analyse plus approfondie par SDS-PAGE et Western Blot. La fraction mitochondriale brute a été purifiée par centrifugation du gradient de densité du saccharose, et une réduction des autres contaminants cellulaires a été observée. La conversion des mitochondries en mitoplastes a été surveillée par la disparition de la protéine de l’espace intermembranaire cytochrome b2 dans la pastille.
Avec l’apparition concomitante dans le surnageant. La dégradation médiée par la protéinase K de la protéine intermembranaire Sco1 a été observée en raison de la perturbation de la membrane externe par choc osmotique. L’intégrité de la membrane mitochondriale externe a été confirmée par la protection du cytochrome b2 et du Sco1 contre la dégradation de la protéinase K dans la fraction granulée.
De même, la protection de la protéine soluble dans la matrice KGD a confirmé l’intégrité de la membrane mitochondriale interne. Le profil de transfert occidental Prx1 suggérait une double localisation mitochondriale dans l’espace et la matrice des intermembranes. Les mitochondries ont été soumises à la sonication et à l’extraction de carbonate pour étudier la topologie des protéines membranaires.
Le coulage intégral de protéines membranaires est resté dans les fractions de granulés. Le KGD a été détecté dans la fraction surnageante. La détection de la protéine KGD dans la pastille était due à des variations des paramètres de sonication affectant la formation des SMP.
Après traitement au carbonate de sodium, la kgD et la fraction SMP ont été solubilisées et trouvées dans la fraction surnageante. Le profil de transfert occidental Prx1 suggère une association avec la périphérie de la membrane. Pour le succès du protocole de fractionnement de la soumissionochondrial, il est important d’arrêter l’activité de la protéinase K après un gonflement hypotonique en ajoutant du PMSF aux échantillons.
Les sites fournissent des informations sur la localisation de la protéine submitochondrial. Ce protocole peut également être utilisé pour vérifier l’intégrité des préparations mitochondriales, ce qui est fondamental lors des études protéomiques des sous-compartiments mitochondriaux.
