Ce protocole décrit l’assemblage et le fonctionnement d’un système acoustofluidique capable de fournir efficacement des biomolécules pour une variété de recherches et d’applications thérapeutiques cellulaires. Le principal avantage de ce système est qu’il permet l’administration rapide de biomolécules aux cellules tout en maintenant leur viabilité. Il s’agit d’une technologie de plateforme qui permet de transformer les cellules pour une variété d’applications thérapeutiques cellulaires, telles que le traitement du cancer.
Commencez par combiner 54 grammes de base PDMS et six grammes d’agent de durcissement dans une tasse. Mélanger vigoureusement et soigneusement avec une spatule pendant au moins une minute, puis placer la tasse avec la solution PDMS dans un desséchér pendant environ 30 minutes ou jusqu’à ce que les bulles d’air résiduelles soient éliminées. Placez une plaquette revêtue de photorésine avec les motifs orientés vers le haut dans une boîte de Petri de 150 millimètres, puis versez la solution PDMS sur le moule.
Si nécessaire, placez la boîte de Petri à l’intérieur d’un dessicateur et appliquez du vide jusqu’à ce que les bulles d’air résiduelles disparaissent. Transférer la boîte de Pétri dans un four de laboratoire et cuire pendant deux heures à 60 degrés Celsius pour durcir le PDMS. Après durcissement, retirez soigneusement le PDMS de la boîte de Pétri en coupant sur les bords de la plaquette avec une lame de rasoir.
Découpez chaque appareil individuel à l’aide d’un couteau ou d’une lame de rasoir, puis percez des trous à travers les orifices d’entrée et de sortie à l’aide d’un poinçon de biopsie de 2,5 millimètres. Après avoir traité le dispositif PDMS avec du plasma d’oxygène, placez immédiatement chaque appareil sur une lame de microscope en verre de chaux soude propre avec des canaux faisant face à la surface du verre. Laissez les appareils se lier pendant la nuit à température ambiante.
Appliquez doucement du silicone sur la surface du transducteur piézo-piézo d’un centimètre de diamètre à une épaisseur d’un à deux millimètres, puis alignez soigneusement le transducteur avec une spirale concentrique et appuyez doucement sur le fond de la lame du microscope en verre. Connectez un microcontrôleur à un ordinateur à l’aide d’un câble USB A vers B. Un voyants LED d’alimentation verte devrait s’allumer.
Utilisez le logiciel associé sur l’ordinateur pour télécharger un programme qui génère un signal de huit mégahertz. Souder un fil d’un pouce de calibre 22 à l’extrémité de chaque fil sur le transducteur PZT. Ensuite, utilisez-le pour connecter le fil de borne négatif du transducteur PZT à une broche GND.
Connectez le fil de borne positif du transducteur PZT à la broche de sortie via le fil soudé. Coupez des sections de trois à six pouces de tubes en plastique souple tygon PVC et poussez le tube dans les ports d’entrée et de sortie. Il peut être nécessaire de faire pivoter le tube tout en appliquant une pression jusqu’à ce qu’il s’adapte à l’ouverture.
Si vous le souhaitez, du colle peut être appliqué à la jonction pour lier le PDMS et le tube ensemble. En option, montez le dispositif acoustofluidique et le microcontrôleur dans un boîtier imprimé en 3D. Assemblez le réservoir microfluidique conformément aux instructions du fabricant.
Coupez une section de trois à six pouces de tube en plastique souple tygon PVC de diamètre intérieur de 1/16 de pouce et poussez-la sur le tube de diamètre intérieur de 1/32 pouce à partir de la sortie du réservoir microfluidique. Si vous le souhaitez, enroulez la jonction avec un film de paraffine pour éviter les fuites. Remplissez une seringue de 60 millilitres avec de l’air ambiant sur le côté du réservoir microfluidique.
Réglez la pompe à seringue à un débit de 200 millilitres par heure pour pousser les solutions d’agent de contraste à travers le dispositif acoustofluidique à un débit volumétrique de 50 millilitres par heure et prélever les échantillons de la sortie de l’appareil dans un tube de centrifugation de 50 millilitres. Préparer une solution de phphopholipide dans un flacon de scintillation de 20 millilitres en ajoutant 25 milligrammes de DSPC, 11,6 milligrammes de DSEPC, 0,26 milligramme de DSPG et 0,88 milligramme de stéarate de polyoxyéthylène40. Ajouter le chloroforme jusqu’à ce que tous les phospholipides soient dissous.
Évaporer le chloroforme dans un dessicateur pendant 48 heures pour former un film lipidique sec. Réhydratez la mousse avec 10 millilitres de PBS stérile, puis soniquez la solution lipidique pendant trois minutes à 40% d’amplitude pour former une solution micellaire cationique. Après sonication, la solution de phphopholipide peut être conservée à deux à six degrés Celsius jusqu’à un mois.
Pour préparer des agents de contraste à ultrasons, ajouter 200 microlitres de solution micellaire cationique dans 600 microlitres de PBS stérile à un flacon de septum en verre à deux millilitres. Scellez le flacon en sertissant le capuchon. Utilisez une aiguille de calibre 20 de 1,5 pouce pour remplir l’espace de tête du flacon avec du décafluorobutane gazeux pendant 30 secondes.
Amalgamer le flacon pour former des agents de contraste à ultrasons remplis de perfluorobutane remplis de gaz. Ajouter 25 microlitres de solution d’agent de contraste à ultrasons par millilitre de solution cellulaire. Ensuite, pompez immédiatement l’agent de contraste combiné et le mélange cellulaire à travers le dispositif acoustofluidique.
Ce protocole produit un système acoustofluidic qui peut être employé pour augmenter la livraison moléculaire intracellulaire dans des variétés de cellule multiples. La livraison intracellulaire d’un composé fluorescent, fluorescéine, aux cellules de T humaines primaires a été améliorée avec le traitement acoustofluidic comparé à un groupe témoin non traité. L’intensité de fluorescence des cellules de T a augmenté de cinq fois après traitement, indiquant la livraison augmentée de fluorescéine.
La viabilité de cellules a diminué légèrement après un traitement acoustofluidic, mais est demeurée au-dessus de 80% Le traitement acoustofluidic a augmenté la livraison intracellulaire d’un trehalose composé conservateur aux cellules humaines de carcinome de poumon A549 comparées à l’écoulement seul et aux cellules dans le groupe témoin non traité. L’ajout des microbulles cationiques à la solution cellulaire est essentiel. L’administration intracellulaire de biomolécules sera limitée sans microbulles cationiques en solution.
Cette plateforme permet l’administration intracellulaire de diverses biomolécules, qui peuvent altérer la fonction cellulaire à des fins de recherche ou thérapeutiques. Après avoir terminé cette procédure, une caractérisation cellulaire supplémentaire peut être effectuée pour évaluer l’impact de l’administration de diverses biomolécules.
