Nous remercions T. Shatova de discussion utile sur la conception expérimentale et l&#39;analyse de données. L&#39;assistance et l&#39;expertise de G. Paradis, le personnel de la cytométrie de flux noyau à l&#39;Institut Koch, et le personnel du Laboratoire de la technologie Microsystems au Massachusetts Institute of Technology grandement appréciée. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de subventions à la santé RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, et en partie par l&#39;Institut national du cancer Cancer Center de soutien (de base) Subventions P30-CA14051 et député-09Call-Langer-60.

Une. Stockage <ol><li> Stocker les réservoirs, supports, joints toriques et des dispositifs microfluidiques dans 70% d&#39;éthanol. Utilisation d&#39;un récipient (par exemple, bocal ou bécher) muni d&#39;un couvercle pour empêcher l&#39;évaporation et la contamination par des particules de poussière ou à l&#39;extérieur. Placez les appareils dans un récipient (1), les réservoirs et les joints toriques dans un second récipient (2), et les détenteurs de la troisième (3). </li></ol> Remarque: L&#39;utilisation d&#39;éthanol à 70% pour le stockage est de maintenir la stérilité. Si les seuls composants de la solution sont l&#39;éthanol et de l&#39;eau (pas de des agents de dénaturation), tous les composants du système doivent être totalement compatibles et ne se dégradent pas au fil du temps. <ol start="2"><li> Changer solution d&#39;éthanol dans des récipients (2) et (3) avant chaque utilisation pour éviter la contamination croisée entre les expériences et minimiser la présence de particules indésirables qui peuvent causer l&#39;obstruction. </li></ol> 2. Expérience Préparation <ol><li> Placer les récipients (2) et (3) dans un bain à ultrasons for 10.5 min avant chaque utilisation. Cela permet de supprimer toutes les particules contaminantes à partir des expériences précédentes. </li><li> Propre espace de travail en matière de biosécurité armoire avec une solution d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Pulvériser tous les matériaux (3 conteneurs, et pinces à épiler) avec une solution d&#39;éthanol à 70% avant de les placer à l&#39;intérieur du poste de sécurité microbiologique. </li></ol> 3. Assemblage <ol><li> Fixées 2-3 lingettes faible charpie dans la zone de travail. </li><li> Retirer les réservoirs en matière plastique à partir de leur récipient avec des pinces et les mettre sur les lingettes pour faciliter l&#39;évaporation de la solution d&#39;éthanol à partir de surfaces intérieures. Tapoter doucement les réservoirs sur la surface ou souffler de l&#39;air à travers eux pour faciliter l&#39;élimination de la solution de l&#39;éthanol. </li><li> Insérer les joints toriques dans leur emplacement approprié sur les réservoirs. </li><li> Retirez le support et les jetons de conteneurs respectifs et permettre à l&#39;éthanol s&#39;évapore (~ 1-2 min). </li><li> Utilisez des pinces pour placer la puce face-up désirée (c.-à-trous d&#39;accès haut) dans le support. Soulevez le supportavec la puce à Eyelevel pour s&#39;assurer que la puce est bien à plat dans le support et ajuster si nécessaire avec la pince à épiler. IMPORTANT: Si l&#39;appareil ne s&#39;adapte pas correctement dans son support, il ya un risque que ça casse lors des étapes ultérieures. </li><li> Ensuite, placez doucement les réservoirs sur le support et les aligner sur les clips. Veillez à ce que les joints toriques ne tombent pas de leurs logements pendant ce processus. </li><li> Appuyez doucement sur les réservoirs jusqu&#39;à ce qu&#39;ils s&#39;enclenchent. Veiller à ce que les deux côtés des réservoirs sont en sécurité et que la puce semble être dans la bonne position. </li></ol> 4. Préparation cellulaire <ol><li> Pour les cellules adhérentes (lignes primaires ou établies): les cellules des plaques de 1 à 2 jours avant l&#39;expérience, de telle sorte qu&#39;ils ne sont plus que 80% de confluence le jour de l&#39;expérience. </li><li> Placez les cellules en suspension (dans du PBS ou support approprié) et viser une concentration d&#39;exploitation de 1,0 x 10 6 cellules / ml à 1,0 x 10 7 cells / ml. NOTE: Nous n&#39;avons pas observé de modifications significatives de la performance de livraison dû à la concentration cellulaire. </li><li> Mélanger les cellules et le matériau de libération souhaité dans un tube séparé pour obtenir la concentration désirée de matière pour l&#39;expérience. IMPORTANT: En raison de la méthode de livraison décrit repose sur la diffusion de faciliter la livraison, une concentration de matière supérieur donnera livraison ultérieure. Si possible, il est recommandé d&#39;utiliser une solution de 1 pM de la matière désirée pour les premiers essais. Cette concentration peut alors être augmentée dans de futures expériences en tant que de besoin. La concentration la plus faible signalée utilisée avec cet appareil est de 10 nM 21. </li></ol> 5. Opération <ol><li> mélange de pipette de cellules et le matériel de livraison dans un réservoir (conception actuelle a un max capacité de 150 pi). REMARQUE: La plupart des modèles d&#39;appareil sont totalement réversibles donc direction d&#39;écoulement dans les canaux n&#39;a pas d&#39;importance. Des échantillons peuvent être chargés dans l&#39;un des deux réservoirs. </li&gt; <li> Fixer le tube de pression dans le réservoir rempli et serrez l&#39;écrou pour assurer une bonne étanchéité (à la main est souvent suffisante). </li><li> Régler la pression au niveau désiré sur le régulateur. Ce contrôle la vitesse à laquelle les cellules se déplacent à travers le dispositif. Notez que les flux de cellule ne démarre pas tant que le bouton est pressé. </li></ol> REMARQUE: Dans des travaux antérieurs, de l&#39;azote ou de l&#39;air comprimé ont travaillé aussi bien comme gaz porteur. <ol start="4"><li> Dispositif pour élever le niveau des yeux et de l&#39;orienter de sorte que le liquide dans le réservoir est facilement visible. NOTE: Suivre la colonne de liquide pour éteindre le système avant que le réservoir est vidé. </li><li> Appuyez sur le bouton pour mettre sous pression le réservoir et commencer flux de cellules. </li><li> Lorsque le niveau du liquide se trouve à environ 2 mm du fond du réservoir, tourner rapidement le régulateur à 0 psi pour arrêter l&#39;écoulement. IMPORTANT: Si l&#39;on ne parvient pas à arrêter l&#39;écoulement avant que le réservoir est vide, on risque d&#39;éjecter l&#39;échantillon de la collection réservoir. Notez aussi que si la colonne de fluide ne se déplace pas à un rythme appréciable, ou a ralenti sensiblement par rapport à son débit initial (par exemple 3x plus lent), le dispositif monté est probablement bouché et doit être échangée. Fonctionnement d&#39;un dispositif bouché peut conduire à la mort cellulaire plus élevé. </li><li> Recueillir les cellules traitées à partir du réservoir approprié et placez-les dans le tube de collecte / plaque désirée. IMPORTANT: Ne pas diluer les cellules recueillies dans tous les tampons à ce stade que les cellules porée continueront d&#39;absorption matériau jusqu&#39;à 10 min 20. Après cette fenêtre a passé, diluer les cellules dans les médias / tampon désiré. </li><li> Pour recueillir des cellules traitées plus ou essayez conditions expérimentales alternatives, répétez les étapes 5.1 à 5.7 selon les besoins. Rappelons que les puces sont réversibles, par conséquent, les échantillons peuvent être montées dans les deux réservoirs. Assurez-vous d&#39;échanger les jetons au besoin si ils bouchent. Jeter dispositifs obstrués. </li></ol> 6. Démontage <ol><li&gt; Débrancher délicatement les réservoirs de la porte principale en écartant les bras de clip. </li><li> Placez chaque partie dans le récipient de stockage approprié (décrit dans la section 1). </li><li> Placez puces utilisées dans un récipient séparé pour l&#39;élimination. </li></ol>

<ol>
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L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonoporation:+Mechanical+DNA+Delivery+by+Ultrasonic+Cavitation.">Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation.</a> Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).</li><li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery.">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonendocytic+Delivery+of+Functional+Engineered+Nanoparticles+into+the+Cytoplasm+of+Live+Cells+Using+a+Novel,+High-Throughput+Microfluidic+Device.">Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device.</a> Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).</li></ol>

Les auteurs Armon sharei, Robert Langer, et Klavs F. Jensen sont actionnaires de Société SQZ Biotechnologies qui produit les dispositifs microfluidiques utilisés dans cet article.

Peuvent avoir besoin d&#39;être optimisé en fonction du type cellulaire et de matériau de libération du système est appliqué à certains aspects de la procédure expérimentale décrite (à savoir les facteurs autres que la conception de la puce et de la vitesse de fonctionnement). La discussion qui suit aborde certaines des facteurs les plus communs à considérer lors de la conception des expériences. Pour améliorer le signal de livraison pour les composés marqués par fl...

Délivrance de macromolécules vers le cytoplasme de la cellule est une étape critique dans les applications thérapeutiques et de recherche. Nanoparticules médiation livraison, par exemple, a montré un potentiel en thérapie génique 1,2, tandis que la prestation de protéine est un moyen prometteur d&#39;affecter la fonction cellulaire à la fois clinique et de laboratoire 3 4 paramètres. D&#39;autres matériaux, tels que les médicaments à petites molécules, des points quantiques, ou des nanoparticules d&#39;or, sont d&#39;un intérêt dans des applications allant de la thérapeutique du cancer de 5,6 à 7,8 marquage intracellulaire, et seule molécule de suivi 9. La membrane cellulaire est en grande partie imperméable aux macromolécules. De nombreuses techniques existantes utilisent des nanoparticules polymériques 10,11 liposomes 12, ou des modifications chimiques 13 à faciliter la rupture de la membrane ou de la livraison d&#39;endocytose. Dans ces procédés, l&#39;efficacité d&#39;administration et de la viabilité des cellules est souvent dépendante de la structure de the molécule cible et du type de cellule. Ces méthodes peuvent être efficaces à la livraison de produits de structure uniforme, tels que les acides nucléiques, mais sont souvent mal adaptés pour la livraison de plus structurellement divers matériaux, tels que les protéines et les nanomatériaux 14,15 7. En outre, le mécanisme de rupture d&#39;endosome que la plupart de ces méthodes s&#39;appuient sur ​​est souvent inefficace, cela laisse donc beaucoup de matériel piégé dans les structures vésiculaires 16. Enfin, les méthodes qui sont souvent développés pour une utilisation avec des lignées cellulaires établies ne se traduisent pas bien de cellules primaires. Membrane de poration méthodes telles que l&#39;électroporation, 17,18 et 19 sonoporation, sont une alternative intéressante dans certaines applications, mais ils sont connus pour provoquer une faible viabilité des cellules et peut être limitée par la charge du matériau de fourniture de cible. Déformation mécanique rapide des cellules, une approche microfluidique à la livraison, a récemment demonstrés ses avantages par rapport aux techniques actuelles, dans le contexte de la reprogrammation de la cellule 20 et la livraison de nanomatériau 21. Cette méthode repose sur la rupture mécanique o la membrane de la cellule pour faciliter la délivrance cytosolique de matériaux présents dans le tampon environnant. Le système a démontré un potentiel permettant de contester auparavant types de cellules (cellules immunitaires primaires et les cellules souches par exemple) et les matériaux (par exemple des anticorps et des nanotubes de carbone). Ici, le mode opératoire général d&#39;utiliser ces dispositifs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules cibles est décrite. La procédure est généralisable à la plupart des types de cellules et de matériaux de livraison, mais il est recommandé que l&#39;on mener une brève optimisation des conditions, comme indiqué dans nos directives de conception signalés précédemment 20, pour les applications non signalés précédemment. A ce jour, le système a été utilisé avec succès pour la fourniture de l&#39;ARN, de l&#39;ADN, des nanoparticules d&#39;or, des points quantiques, des nanotubes de carbone, des protéiness, et des polymères de dextrane 20,21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:375px;">Device Holder &#38; Plastic reservoir</td>
			<td style="width:136px;">SQZ Biotechnologies</td>
			<td style="width:149px;">Holder</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LSRFortessa Analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microfluidic device</td>
			<td>SQZ Biotechnologies</td>
			<td>Cell Squeeze</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">O-Rings</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>9452K311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pressure system to operate device</td>
			<td>SQZ Biotechnologies</td>
			<td>Pressure System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasound bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell squeezing as a robust, microfluidic intracellular delivery platform

Déformation mécanique rapide des cellules a émergé comme une méthode prometteuse, indemne de vecteurs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules et des nanomatériaux. Cette technologie a démontré un potentiel dans le traitement des demandes auparavant difficiles, y compris, la livraison de cellules primaires du système immunitaire, la reprogrammation cellulaire, nanotubes de carbone, et la prestation de point quantique. Cette plate-forme microfluidique indemne de vecteurs repose sur une rupture mécanique de la membrane de la cellule pour faciliter la délivrance cytosolique de la matière cible. Nous décrivons ici la méthode détaillée de l&#39;utilisation de ces dispositifs microfluidiques, y compris, le montage du dispositif, de la préparation cellulaire, et le fonctionnement du système. Cette approche de livraison nécessite un bref optimisation du type d&#39;appareil et les conditions d&#39;exploitation pour les applications non signalés précédemment. Les instructions fournies sont généralisables à la plupart des types de cellules et des matières de livraison, ce système ne nécessite pas des tampons spécialisés ou des étapes de modification chimique / d&#39;orthographe. Ce travail permet également des des recommandations sur la façon d&#39;améliorer les performances de l&#39;appareil et dépanner les problèmes potentiels liés à l&#39;obstruction, l&#39;efficacité de la prestation faibles, et la viabilité cellulaire.

La figure 1 contient un schéma descriptif du système de délivrance microfluidique. Figures 2a-b illustrent des résultats représentatifs de traitement de cellules HeLa avec différents modèles d&#39;appareil en présence de fluorescence conjugué dextrane 20 3 kDa. Si la procédure est correctement suivie, la performance du système sera sensible à type d&#39;appareil et la vitesse de fonctionnement. Par conséquent, il faut optimiser ces conditions pour une application...

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Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Déformation mécanique rapide des cellules a émergé comme une méthode prometteuse, indemne de vecteurs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules et des nanomatériaux. Ce protocole fournit des instructions détaillées sur la façon d&#39;utiliser le système pour une large gamme d&#39;applications.

Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

cell-squeezing-as-robust-microfluidic-intracellular-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.7K vues.  Massachusetts Institute of Technology.  Déformation mécanique rapide des cellules a émergé comme une méthode prometteuse, indemne de vecteurs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules et des nanomatériaux. Ce protocole fournit des instructions détaillées sur la façon d'utiliser le système pour une large gamme d'applications. 

Vidéo: Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcapsules d&#39;alginate comme une plate-forme 3D pour la Propagation et différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à différentes lignées

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Recherche

Bio-ingénierie

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Le Multi-Chip organes - Une plate-forme microfluidique à long terme Coculture multi-tissus

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Plate-forme microfluidique avec multiplexée Détection électronique pour le suivi spatial des particules

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

La morphologie de poils absorbants d’Arabidopsis semis dans une bicouche Microfluidic plateforme d’imagerie

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Une plate-forme microfluidique d’imagerie longitudinales chez Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Une plate-forme de Microfluidic ultra haute capacité pour le séquençage du génome de cellules individuelles

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Une plate-forme microfluidique multicouche pour la conduite d'une expression génique prolongée sans cellules

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Une plate-forme microfluidique pour stimuler les chondrocytes avec compression dynamique

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...