Nous remercions Chandran Sabanayagam pour son aide dans le développement du système, Joshua Edel pour des conseils sur la conception du dispositif microfluidique et le personnel de l&#39;Institut de Rowland à l&#39;Université Harvard pour l&#39;usinage de pièces de l&#39;installation. Nous reconnaissons les discussions utiles avec les membres du groupe de Meller à l&#39;Institut Rowland et l&#39;Université de Boston, et les membres du groupe T. Ha &#39;s à l&#39;UIUC pour des renseignements utiles. Enfin, nous apprécions le soutien financier de la National Science Foundation (PHY-0701207) et l&#39;Institut national de la santé (GM075893).

1 - Assemblage de la cellule microfluidique La cellule microfluidique est fait par fusion d&#39;un motif, 2 mm d&#39;épaisseur, polydiméthylsiloxane (PDMS) de disque à une lamelle de quartz fraîchement nettoyée. Le disque contient quatre PDMS 30 pl chambres rectangulaires qui sont accessibles par entrée et de sortie flexibles capillaires relié à un réservoir tampon et une pompe seringue, respectivement, pour les flux contrôlé de tampon. La cellule d&#39;écoulement est pris en charge sur sa face arrière par une fenêtre en verre et placé sur un support de cuve sur-mesure contenant une eau refroidie élément thermoélectrique pour réguler la température. <ol><li> Pour rendre le modelé PDMS disque, mélange de base 10 pièces en élastomère silicone avec une partie de durcisseur, bien mélanger et laisser le dégazage pendant 1 heure dans le vide. </li><li> Verser délicatement le mélange sur le moule en élastomère cellulaire microfluidique. Dans notre cas, il s&#39;agit d&#39;une plaquette de silicium 1 &quot;avec quatre bandes (1x10 1x10 4 x 3 x 300 um) fabriqués à partir de résine photosensible négative. Laissez ce pour guérir sur une plaque chaude à 70 ° C pendant deux heures. </li><li> Retirer délicatement le disque guéri PDMS à partir du moule en utilisant une lame de rasoir. Fusible du disque sur une fenêtre 1 verre&#39;&#39;(contenant 8 x 2 mm de diamètre trous pré-percés aux deux extrémités des canaux) par plasma oxydant deux surfaces pendant 30 secondes. Fusible les fenêtres de verre sur le côté plat du disque PDMS (le côté ne contenant pas les canaux). </li><li> Insérez un 2-pouce de long tube flexible capillaire en silice fondue à travers le trou de chaque fenêtre en verre jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne le canal. Insertion d&#39;une aiguille d&#39;abord, puis la suite avec le capillaire peut faciliter ce processus. Scellez les trous fenêtre en verre en utilisant un moyen rapide de cure coulée de silicone comme les Kwik-Cast. </li><li> Rincez les canaux avec de l&#39;éthanol et d&#39;eau, et le plasma-activer la cellule avec un fraîchement nettoyée, 1 pouce lamelle circulaire de quartz pendant 30 secondes. Nous vous suggérons de nettoyer ce lamelle en utilisant piranha *. Fusible la lamelle sur le côté de la cellule contenant les canaux, étanchéité des chambres. </li><li> Laisser la cellule assemblée pour guérir une nuit à température ambiante. </li></ol> * Piranha est une solution de H 2 O 2 et H 2 SO 4 dans des proportions 1:2.5. Pour nettoyer les lamelles, les plonger dans le piranha à 90 ° C pendant 20 min. 2 - Activer la surface pour l&#39;immobilisation molécule Pour les études d&#39;acides nucléiques, le schéma simple de surface immobilisation consiste à enduire d&#39;abord un verre ou lamelle de quartz avec biotinylé albumine sérique bovine (BSA), puis avec streptavidine. Cela permet à l&#39;échantillon biotinylé à être immobilisé avec une haute spécificité pour les jours à température ambiante. <ol><li> Relier les tubes flexibles pour les capillaires pour l&#39;injection de tampon facile en utilisant une seringue et une aiguille. </li><li> Injecter une solution de 0,1 mg / ml de BSA biotinylé dans le tampon A (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM, filtrés en utilisant des filtres 0,02 um) dans le canal et incuber pendant au moins 30 min. </li><li> Débit de 300 à 500 pi de tampon A à enlever toute la BSA biotinylé libre à partir du canal, en faisant attention à ne pas coincer les bulles d&#39;air dans la chambre. </li><li> Injecter une solution de 0,1 mg / ml de streptavidine dans le tampon A et incuber pendant 15 min. Ensuite, répétez l&#39;étape 3. </li><li> L&#39;écoulement à travers une solution 3-5 pM de l&#39;échantillon biotinylé. Effectuer une analyse de surface pour vérifier la couverture des molécules fluorescentes. Si nécessaire, augmenter la concentration de l&#39;échantillon afin d&#39;obtenir une meilleure couverture. Incuber pendant 10 min et répétez l&#39;étape 3. </li></ol> La cellule microfluidique est monté sur une platine motorisée xy permettant grossier (jusqu&#39;à 25 mm) en utilisant le mouvement optiquement encodée moteurs à courant continu, et de fin (1 nm) en utilisant deux mouvements en boucle fermée actionneurs piézoélectriques (Physik Instrumente modèle M-014 ou similaire). Cela peut être fait avant ou après l&#39;activation de la surface pour l&#39;immobilisation de l&#39;échantillon. 3 - Préparer le tampon d&#39;imagerie (IB) L&#39;IB est constitué d&#39;un système d&#39;oxygène enzymatique balayage et un extincteur triplet, comme Trolox. Depuis l&#39;IB est rincé en permanence grâce à la nuit, au moins 10 ml doit être préparé à l&#39;avance. <ol><li> Préparer 10 ml de 0,8% p / v de D-glucose, au moins 35 mM Tris-HCl pH 8,0 et NaCl 50 mM dans de l&#39;eau déminéralisée. La plus forte concentration de tampon est important pour deux raisons: Trolox dissolution sera acidifier la solution, et la réaction enzymatique va aussi abaisser le pH de la solution au fil du temps. Depuis cette solution a une longue durée de vie peut être stocké sous forme de solution stock. </li><li> Dissolvez 5 mg de Trolox dans le tampon préparé à l&#39;étape 1 par vortex pendant quelques minutes puis agiter pendant&gt; 10 min. Trolox n&#39;est pas très soluble dans l&#39;eau à pH&gt; 7, donc ne vous précipitez pas cette étape. Filtrer la solution en utilisant un filtre de 0,2 um et de laisser le dégazage sous vide pendant 10 minutes. </li><li> Préparer le «gloxy&quot; solution enzymatique en mélangeant 60 ul water, 20 pl de tampon 5X A, 20 pl de la catalase, glucose oxydase 1 mg et 100 ul de 10 mg / ml de BSA. Filtrer la solution en utilisant un filtre de 0,22 um centrifugeuse. </li><li> Mélanger délicatement le tampon de l&#39;étape 2 avec le &quot;gloxy« solution de l&#39;étape 3 en évitant la formation de bulles d&#39;air. </li><li> Débit de l&#39;IB à travers le canal à un taux constant de 5 pl / min en utilisant une pompe seringue mécanique pour contrôler le débit. Bubble gaz argon dans le réservoir pour empêcher IB oxygène atmosphérique de re-dissoudre dans la mémoire tampon. </li></ol> Le balayage de surface, la localisation et l&#39;acquisition de molécules simples traces d&#39;intensité molécule est contrôlé par un programme LabVIEW qui permet la collecte automatisée de données 1. Le programme scanne 20x20 um deux zones à une résolution de 0,2 um, avec un taux de 0,1 um / ms. Les données sont immédiatement traitées pour produire l&#39;intensité pondéré emplacements de tous les pixels au-dessus des comptages de fond. Une fois les molécules immobilisées sont trouvés, ils sont déplacés un par un dans le volume confocal et les intensités des donateurs et fluorophore accepteur sont enregistrés en fonction du temps jusqu&#39;à deux photobleach fluorophores. La scène est alors programmé pour passer à une nouvelle origine 100 um loin, et le processus de numérisation est répété. 4 - Les résultats représentatifs Voici quelques images montrant la cellule microfluidique assemblés avant l&#39;activation de surface et après être monté sur le microscope prêt pour l&#39;immobilisation molécule. Si le canal est activé avec succès, balaye la surface devrait être similaire à l&#39;analyse décrite ci-dessous montrant d&#39;émission du donneur (vert) de teinture et de l&#39;accepteur (rouge) après l&#39;excitation directe des bailleurs de fonds. Ces molécules sont déplacés un par un dans le volume de sondage et la fluorescence est enregistrée au cours du temps jusqu&#39;à ce que les colorants photobleach, comme le montre les traces molécule unique. De traces comme celles-ci on peut obtenir l&#39;efficacité de FRET qui informe sur les instantanés donneur-accepteur de séparation, qui à son tour, est utilisé pour explorer la structure et la dynamique des molécules d&#39;intérêt biologique. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Figure 1" border="0" /> Figure 1: cellule microfluidique avec quatre canaux, chacun avec entrée / sortie des capillaires. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Figure 2" border="0" /> Figure 2: Cellule montée sur le microscope prêt pour les mesures. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 2. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Figure 3" border="0" /> Figure 3: Configuration pour SM-mesures de FRET. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 3. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Figure 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Figure 5" border="0" /> Figures 4 et 5: canal rouge et vert d&#39;une analyse de surface des molécules excitées immobilisé FRET avec le laser vert. S&#39;il vous plaît cliquer pour voir une version agrandie de la <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">figure 4</a> , ou <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">la figure 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Figure 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Figure 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Figure 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Figure 9" border="0" /> Les figures 6, 7, 8 et 9: Intensité des trajectoires des bailleurs de fonds (en vert) et accepteur (rouge) fluorophores étiqueté à une molécule d&#39;ADN 8, 10, 16 et 18 paires de bases d&#39;intervalle. S&#39;il vous plaît cliquer pour voir une version agrandie de la <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">figure 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">figure 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">figure 8</a> , ou <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">9 chiffres</a> .

<ol>
	<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Techniques,+a+Laboratory+Manual.">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis.">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules:+Corrections+due+to+nonideal+transfer.">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li><li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li><li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Article in preparation. , .</li></ol>

Bien que le protocole ci-dessus a été optimisé pour notre système particulier et pour un choix spécifique de teintures (TMR et ATTO647N), il n&#39;est en aucun cas la seule méthode prouvée. Récemment, un système d&#39;oxygène alternatives balayage constitué d&#39;acide protocatéchique (PCA) / ​​protocatéchuate-3 ,4-dioxygénase (PCD) a été montré pour augmenter la photostabilité de certains colorants 4. De même, les autres triplet-état quenchers tels que β-mercaptoéthanol (BME) peut être utilisé à la place de Trolox, bien que ceux-ci pourraient ne pas supprimer la longue durée de clignoter de certains colorants, en particulier Cy5 5. Bien immobilisation par biotine-streptavidine biotinylé albumine sérique bovine (BSA) est le choix préféré pour les études des acides nucléiques, un polyéthylène glycol (PEG) à revêtement de surface est mieux adapté pour les études des protéines car elle empêche les non-adhérence spécifique 1. En outre, les sous-diffraction limitée vésicules taille peut être utilisé pour encapsuler des biomolécules d&#39;intérêt dans les cas où elle peut être affectée par les interactions de surface 6. Dans cet article, nous avons utilisé une configuration confocale équipé photodiodes à avalanche en silicone pour acquérir les traces d&#39;intensité de fluorescence. Ce protocole fonctionne aussi bien avec Total Internal Reflection Fluorescence microscopes (FRBR) équipé de caméras CCD. Indépendamment de la microscopie à utiliser, sm-FRET peut informer sur les résolutions spatiales approcher l&#39;angström lorsque le donateur et le signal de l&#39;accepteur sont correctement corrigés 7.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>TSP150375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica cover slip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Esco Products</td>
<td>R425000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diba Industries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9085</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>0021122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DowCorning</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>Silicone Elastomer Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Trolox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>238813</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose Oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kwik-Cast Sealant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>Kwik-Cast</td>
<td>Silicone Casting Compound</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopie a été largement utilisée pour étudier la structure et la dynamique des molécules d&#39;intérêt biologique, tels que les acides nucléiques et des protéines. Seule molécule de FRET (sm-FRET) des mesures sur molécules immobilisées permettent des observations à long du système de manière efficace tant que les deux colorants photobleach-résultant en temps des traces de ce rapport sur la dynamique biomoléculaire avec un large éventail d&#39;échelles de temps allant de quelques millisecondes à quelques minutes. Pour faciliter l&#39;acquisition d&#39;un grand nombre de traces pour les analyses statistiques, le processus doit être automatisé et l&#39;environnement de l&#39;échantillon doit être étroitement contrôlé sur le temps de mesure entière (~ 12 heures). Ceci est accompli en utilisant un microscope confocal à balayage automatisé qui permet à l&#39;interrogatoire de milliers de molécules uniques pendant la nuit, et une cellule microfluidique qui permet l&#39;échange contrôlé de tampon, avec la teneur en oxygène limité et maintient une température constante pendant toute la période de mesure. Ici, nous montrons comment assembler le dispositif microfluidique et comment activer sa surface pour l&#39;immobilisation d&#39;ADN. Ensuite, nous expliquent comment préparer un tampon pour maximiser la durée de vie et de photostabilité des fluorophores. Enfin, nous montrons les étapes impliquées dans la préparation de l&#39;installation pour l&#39;acquisition automatisée de résolution dans le temps seule molécule FRET traces de molécules d&#39;ADN.

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Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Dans cet article, nous décrivons comment nous obtenons FRET traces de molécules individuelles d&#39;ADN immobilisés sur une surface en utilisant un microscope confocal à balayage automatisé.

Système automatisé pour les simples mesures de fluorescence de la molécule de surface immobilisée Biomolécules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K vues.  Boston University. Dans cet article, nous décrivons comment nous obtenons FRET traces de molécules individuelles d'ADN immobilisés sur une surface en utilisant un microscope confocal à balayage automatisé.

Vidéo: Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Méthodes Single Molecule pour surveiller les changements dans les propriétés élastique bicouche

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Recherche

Biologie

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualisation de la réplication d&#39;ADN molécule unique par microscopie à fluorescence

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Molécules simples à l&#39;imagerie du transport nucléaire

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Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

La combinaison unique molécule manipulation et d&#39;imagerie pour l&#39;étude des interactions protéine-ADN

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Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Étude de l&#39;ADN Looping par une seule molécule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source Content Haute Analyse Utilisant automatisé Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Méthode pour l’étiquetage des transcriptions dans les cellules individuelles Escherichia coli pour Single-molecule Fluorescence In Situ des expériences d’hybridation

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Isolement et imagerie de Fluorescence pour la Reconstruction de la particule de Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing the innate cellular fluorescence signature from each individual live cell in a population distributed in a three-dimensional (3D) space. The innate fluorescence signature of a cell is a collection of fluorescence signals emitted by various biomolecules within the cell. Previous studies established that innate fluorescence signatures reflect various cellular properties and differences in physiological status and are a rich source of information for cell characterization and identification. Innate fluorescence signatures have been traditionally analyzed at the population level, necessitating a clonal culture, but not at the single-cell level. CRIF is particularly suitable for studies that require 3D resolution and/or selective extraction of fluorescence signals from individual cells. Because the fluorescence signature is an innate property of a cell, CRIF is also suitable for tag-free prediction of the type and/or physiological status of intact and single cells. This method may be a powerful tool for streamlined cell analysis, where the phenotype of each single cell in a heterogenous population can be directly assessed by its autofluorescence signature under a microscope without cell tagging.

Here, a protocol is presented for optically extracting and cataloging innate cellular fluorescence signatures (i.e., cellular autofluorescence) from every individual live cell distributed in a three-dimensional space. This method is suitable for studying the innate fluorescence signature of diverse biological systems at a single-cell resolution, including cells from bacteria, fungi, yeasts, plants, and animals.

Reconstruction de signatures de fluorescence innées unicellulaires par microscopie confocale

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

Essai cinétique à molécule unique à haut débit parallèle pour le clivage d’ADN spécifique au site

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...