Ce protocole est important, car il fournit une méthode pour séparer quatre compartiments cellulaires les uns des autres, le cytoplasme, le noyau, les mitochondries et la membrane. Non seulement cela, mais c’est une procédure évolutive et reproductible qui a des résultats fiables. Le principal avantage de cette technique est la séparation de quatre compartiments cellulaires avec une utilisation minimale de détergents, ce qui permet une procédure de fractionnement beaucoup plus reproductible et fiable.
Pour l’isolement des protéines cytosoliques, cultiver des cellules U937 dans RPMI 1640 avec 10% de sérum bovin fœtal à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à un total final de six par 10 aux cellules huitièmes. Centrifuger la culture et remettre en suspension la pastille cellulaire dans du PBS à température ambiante jusqu’à une concentration finale de quatre par 10 à la sixième cellule par millilitre, en pipetant doucement pour briser les touffes. Après une deuxième centrifugation, remettre en suspension la pastille dans un tampon de lyse glacée A à une concentration finale de deux par 10 à la septième cellule par millilitre.
Ajouter 7,5 millilitres de cellules dans un tube conique sur de la glace pour l’extraction des protéines nucléaires en aval, et enduire les cellules restantes par centrifugation. Resuspendre la pastille dans un tampon d’isolement cytoplasmique à une concentration finale de deux par 10 à la septième cellule par millilitre, en pipetant doucement pour briser les touffes, avant d’incuber les cellules pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius avec rotation bout à bout. À la fin de l’incubation, centrifuger la suspension cellulaire et transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre.
Centrifuger le surnageant pour sédimenter les débris cellulaires. Après la centrifugation, transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger et répéter la séquence de centrifugation jusqu’à ce qu’aucune pastille ne puisse être observée. Lorsque l’échantillon est exempt de débris, conservez le surnageant contenant une fraction cytosolique jusqu’à un mois à quatre degrés Celsius.
Ensuite, remettre en suspension la pastille de cellule stockée dans le tampon de lyse A à une concentration finale de quatre par 10 à la sixième cellule par millilitre. Pour l’homogénéisation cellulaire, centrifuger la suspension cellulaire et jeter le surnageant pour éliminer l’excès de digitonine et de contaminants systoliques. Remettez en suspension la pastille dans un tampon d’homogénéisation des cellules glacées à une concentration finale de quatre par 10 à la sixième cellule par millilitre pour une incubation de 30 minutes sur de la glace.
Pendant ce temps, pour la lyse mécanique à base de billes, ajoutez 30 grammes de perles de 3,2 millimètres en acier inoxydable prélavées à 15 millilitres de tampon de lyse B dans un tube à jupe de 50 millilitres sur glace pour refroidir. À la fin de l’incubation, remplacez le tampon dans le tube jupe par une suspension cellulaire et mélangez les cellules pendant cinq minutes à la vitesse huit. Après lyse, transférer l’homogénat dans un tube propre.
Centrifuger l’homogénat, puis transférer le surnageant dans un nouveau tube. Pour éliminer les débris restants de l’échantillon, centrifuger l’homogénat trois fois comme indiqué, en transférant le surnageant dans un nouveau tube après chaque centrifugation. Après la dernière centrifugation, pour isoler la fraction mitochondriale brute, transférer le surnageant dans un nouveau tube pour centrifugation.
Après centrifugation, transférer le surnageant dans un nouveau tube et placer la pastille brute contenant des fractions mitochondriales sur de la glace. Pour isoler la fraction membranaire, centrifuger le surnageant collecté et, après avoir jeté le surnageant, placer la pastille contenant la fraction membranaire brute sur de la glace. Pour la purification du gradient de densité isopycnique, remettre en suspension les pastilles brutes de fraction mitochondriale et membranaire dans 200 microlitres de tampon de lyse B et 1,8 millilitre d’iodixanol.
Pour créer un gradient discontinu d’iodixanol pour chaque échantillon, ajoutez d’abord un millilitre d’iodixanol à 15% au fond d’un tube ultracentrifuge à paroi mince à toit ouvert de huit millilitres par échantillon. Ensuite, sous-tendez séquentiellement un millilitre de 20% iodixanol, un millilitre de 25% iodixanol, un millilitre de 30% iodixanol et un millilitre de 35% iodixanol sous la couche 15% iodixanol dans chaque tube. Ajouter deux millilitres de la suspension de granulés mitochondriaux bruts sous la couche inférieure d’un gradient, et deux millilitres de la suspension de granulés de membrane brute sous la couche inférieure du deuxième gradient.
Déposer soigneusement un millilitre de 10% iodixanol sur le dessus de chaque gradient et équilibrer les tubes à moins de 10 microgrammes les uns des autres en ajoutant 10% d’iodixanol si nécessaire avant de purifier les fractions mitochondriales et membranaires par centrifugation du gradient de densité. À la fin de la séparation, utilisez une aiguille pour percer le côté des tubes à paroi mince afin de recueillir les bandes visibles de chaque échantillon. Pour l’isolement des protéines nucléaires, centrifuger l’aliquote de 7,5 millilitres des cellules en suspension dans le tampon de lyse A et remettre la pastille en suspension dans 800 microlitres de tampon de solubilisation des cellules glacées avec pipetage et vortex.
Incuber la suspension sur de la glace pendant 30 minutes pour perturber les membranes plasmatiques et organitiques, tout en protégeant les protéines nucléaires. À la fin de l’incubation, centrifuger la suspension cellulaire et remettre en suspension la pastille en pipetant doucement dans 800 microlitres de tampon de lyse nucléaire glacée complétée par une unité par microlitre de benzonase. Incuber le mélange sur un rotateur bout à bout à quatre degrés Celsius pour perturber la membrane nucléaire.
Après 30 minutes, sonifier le mélange trois fois pendant cinq secondes à 20% de puissance avec une pause de cinq secondes entre les impulsions pour cisailler les acides nucléiques. Après la dernière sonication, centrifuger l’homogénat et recueillir le surnageant comme fraction nucléaire sans perturber la pastille. Le transfert Western de chacune des fractions après purification du gradient de densité montre la localisation de la fraction mitochondriale aux couches de 25 et 30% d’iodixanol, et la localisation de la fraction membranaire aux couches d’iodixanol à 10 et 15%.
L’analyse sanguine Western confirme également que chaque échantillon isolé est pur et exempt de contamination par des protéines provenant d’autres parties de la cellule. De plus, l’analyse densitométrique de l’intensité de la bande de chaque échantillon confirme la reproductibilité et la signification statistique des données. Une mauvaise exécution du fractionnement peut entraîner une contamination croisée des composants cellulaires.
Une concentration élevée d’histone H3 dans la fraction cytosolique, par exemple, peut être due à une mauvaise clarification de la fraction cytosolique. Une défaillance lors de la purification de la densité isopycnique peut entraîner une contamination de la fraction membranaire. Il peut être utile d’effectuer un test de quantification des protéines avant l’analyse sanguine occidentale pour confirmer que les fractions contiennent bien des protéines afin de permettre la charge du gel en fonction de la quantité de protéines et pour confirmer que la procédure a été correctement exécutée.
Il est essentiel que la fraction cytoplasmique ne contienne pas de pastille. Des Western blots, ou ELISA, peuvent être effectués en suivant cette procédure pour vous permettre d’analyser l’emplacement subcellulaire de différentes protéines dans certaines conditions. Cette technique nous a permis d’analyser le trafic de différents facteurs de mort cellulaire dans des conditions d’hyperglycémie.
Et donc, pour nous, cela a aidé à faire la lumière sur le mécanisme du passage hyperglycémique de l’apoptose à la nécrose.
